[发明专利]棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子及活性分析

说明书

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及一段DNA序列，它可以作为启动子调控基因的表达，具体涉及一种来源于棉蚜P450基因CYP6A2，并在细胞中高度表达的诱导型启动子序列。 

背景技术

棉蚜(Aphis gossypii)是一种危害严重的世界性农业害虫，它通过取食和病毒传播来危害农作物，并已对多种杀虫剂产生了抗药性。螺虫乙酯是有效防治抗性棉蚜的季酮酸类杀虫剂。前期研究结果表明，棉蚜细胞色素P450基因CPY6A2表达量在螺虫乙酯抗性棉蚜中高水平表达。这可能是棉蚜对螺虫乙酯产生代谢抗性的重要原因。这也显示出棉蚜CYP6A2基因启动子极可能具有较高诱导活性。因此，对于新的高活性的棉蚜相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究具有重要意义,将为深入研究害虫抗药性机制及新型抗虫新品种的研制奠定基础。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列，该启动子序列能够诱导目的基因高水平表达，而且该启动子来源于棉蚜P450基因CYPA2。 

本发明的第二个目的是提供一种用于真核细胞转染的CYP6A2启动子真核表达载体，该载体指导高水平表达目的基因CYP6A2的启动子序列和5'非翻译区。 

本发明的第三个目的是提供一种所述真核细胞表达载体的表达，该载体的表达能反映启动子活性的高低。 

为实现上述目的，本发明克隆了棉蚜P450基因CYP6A2的启动子区，并构建了真核表达载体，所述载体包含带有CYP6A2基因的5'非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在Sf9细胞中表达，并检测到该启动子的高水平活性。 

本发明提供一种获得的棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列，所述启动子序列如SEQ ID NO:1所示，其中SEQ ID NO：1的-1bp至-489bp区(见序列表)为棉蚜CYP6A2启动子的DNA序列，在真核细胞中，本发明所述的启动子具有高水平活性。 

获得的棉酚螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列源自棉蚜P450基因CYP6A2。 

SEQ ID NO:1的+1bp至+56bp区(见序列表)为克隆得到的棉蚜P450基因CYP6A2的5'非翻译区的DNA序列，本发明所述的棉蚜CYP6A2基因的5'非翻译区能在Sf9细胞中通过增强目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。 

为实现另一个目的，本发明提供一种用于细胞系转染的真核细胞表达载体，所述真核细胞表达载体包含棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列。 

上述用于Sf9细胞转染的真核表达载体是指能够在细胞中瞬时、高水平表达外源基因的载体。例如pGL3载体、pGL4载体。 

一种用真核细胞表达载体的表达，所述真核细胞表达包含棉蚜螺虫乙酯抗性相关CYP6A2启动子序列。 

关于本发明所述的用于真核细胞的表达载体(pGL3)，所述的棉蚜CYP6A2基因的启动子和5'非翻译区在表达载体中位于外源基因(Luc+)的前面。本发明提供通过插入本发明所述的棉蚜CYP6A2基因的启动子和5'非翻译区至含有Luc+报告基因的载体中而构建的pGL3-CYP6A2(-489/+134)。但是，所述Luc+报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。 

本发明提供来自棉蚜CYP6A2基因的启动子和5'非翻译区，根据本发明的启动子和5'非翻译区使得能够在真核细胞中进行高水平的表达。 

本发明的有益效果在于：可用于真核基因的高效表达，用于获得低丰度基因研究，使其获得高水平、稳定表达，对于目的功能研究具有积极意义。 

附图说明

图1为棉蚜基因组电泳图 

图2为Genome walker PCR电泳图 

图3为CYP6A2连T载酶切鉴定电泳图 

图4为CYP6A2连pGL3PCR鉴定电泳图 

图5为CYP6A2连pGL3酶切鉴定电泳图 

图6为pGL3-CYP6A2(-489/+134)转染Sf9细胞后启动子活性检测示意图 

图7为pGL3-CYP6A2(-489/+134)表达载体示意图 

具体实施方式