[发明专利]一种三明治样多细胞片层的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学组织工程领域，尤其是关于一种多细胞片层的制备方法。

背景技术

随着生命科学的发展，机体由于损伤和病变造成的组织缺损由组织工程的方法进行替代与再生已成为现代医学的热点。组织工程技术的基本要素包括有良好应答特性的组织细胞、起支撑作用的细胞外基质以及促进细胞和组织再生的生物活性因子。组织工程的最重要要素是种子细胞、支架，其关键技术是将种子细胞接种于塑形的可降解生物材料植入体内，生长以形成所需组织。传统组织工程修复缺损的方式一般有两种：一是细胞或细胞团直接注射或放置在缺损局部；二是将细胞接种于可降解的生物支架上，这种方法在组织工程中应用最广，然而，支架中心部位细胞量少，细胞存活率低是组织工程有待解决的难题。

由于现有组织工程方法的局限，日本科学家提出了一种全新的组织工程构建方法：细胞片层工程。在组织发生过程中，多种细胞层相互作用，相互协调，共同行使功能。如果在组织工程中也能通过细胞一层一层相互结合，共同作用，就可以克服单个细胞及支架的弊端，模拟正常组织的发生过程。经细胞片层技术收获细胞无需胰蛋白酶的消化作用便可自动从培养皿表面分离。收获的细胞是含有细胞外基质的一层完整的片状结构，含有离子通道、生长因子受体和连接蛋白等重要的细胞表面蛋白。因此，应用细胞片层技术构建的组织结构更接近于正常组织。

细胞片层技术虽然可以克服传统组织工程方法的种种不足，但该方法仍有些问题亟待解决。与其他组织工程方法一样，应用细胞片层技术进行组织重建时，种子细胞的获取比较困难；叠加的细胞片层超过一定厚度时，常导致内部细胞的坏死；应用细胞片层技术构建大的功能性组织结构仍是细胞片层技术面临的一大难题。支架技术和细胞片层技术的结合将有助于大块组织的重建。

发明内容

本发明提供一种新的三明治样多细胞片层的制备方法。

本发明提供一种三明治样多细胞片层的制备方法，包括如下步骤：

电纺液配制步骤，向三氟乙醇溶剂中加入壳聚糖和胶原，所述壳聚糖和胶原的质量比范围是1:4～4:1，搅拌得到电纺液；

静电纺丝步骤，将所述电纺液高压静电纺丝得到壳聚糖-胶原电纺生物膜；

细胞-膜-细胞多细胞片层构建步骤，将两个细胞片层分别附着在所述壳聚糖-胶原电纺生物膜两面生长，最终得到细胞-膜-细胞多细胞片层。

制备三氟乙醇溶剂时，可以按1：1体积比配制好2,2,2-三氟乙醇和蒸馏水作为溶剂，即溶剂可以为50％浓度的三氟乙醇。

所述壳聚糖为蟹壳壳聚糖，其脱乙酰度为98％；胶原为Ⅰ型鼠尾胶原，分子量在1-30万之间。

所述壳聚糖和胶原的质量比选自2：8、3：7、5：5、7：3和8：2。

所述壳聚糖和胶原的质量比为7：3。

所述电纺液的浓度为15％。该浓度是指壳聚糖和胶原在三氟乙醇溶剂中的浓度。

所述搅拌的速度是500～1000rpm，所述搅拌的时间是2～5h。

所述静电纺丝步骤中，通过高压静电纺丝装置进行高压静电纺丝，所述高压静电纺丝装置包括高压电源、喷射装置和接收装置，所述高压电源提供的电压是8～15kv，所述喷射装置所需针头型号为5～9号，所述针头与接收装置的距离为9～15cm，所述喷射装置送液速度为0.5～1.5ml/h。高压静电纺丝装置可以包括溶液存储装置。静电纺丝的温度可以是25℃。

所述细胞-膜-细胞多细胞片层构建步骤中，将灭菌后的所述壳聚糖-胶原电纺生物膜置于在第一温敏培养皿表面已生长融合的第一细胞片层上；降低温敏培养表面的温度至20-25℃，10-30min后将所述第一细胞片层从边缘剥离；上下颠倒附着有所述第一细胞片层的壳聚糖-胶原电纺膜，并将其置于第二温敏培养皿的第二细胞片层上，形成的多细胞片层在温敏培养表面生长后，降低温敏培养表面的温度至20-25℃，10-30min后剥离得到所述细胞-膜-细胞多细胞片层。

细胞片层可以是单细胞片层，如脂肪干细胞片层。

降低温敏培养表面的温度至20℃，10min后剥离细胞片层。该剥离细胞片层包括剥离第一细胞片层和剥离整个多细胞片层。

形成的所述多细胞片层在温敏培养表面生长的时间为3天。

较佳的，电纺液的搅拌时间为4h，搅拌速度为500rpm。

较佳的，所述的喷射装置中所需针头型号为6号。

较佳的，所述针头与接收装置的距离为14cm。

较佳的，所述喷射装置送液速度为1ml/h。