[发明专利]一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系及文库构建方法

权利要求书

1.一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系，其特征在于， 所述扩增体系包含下述组份：

超纯水19μl；DNA模板15μl；反应缓冲液5μl；上游引物2.5μl；下 游引物2.5μl；2.5mMdNTP5μl；热启动DNA聚合酶1μl。

2.根据权利要求1所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增 体系，其特征在于，所述反应缓冲液为PfuTurboCx反应缓冲液，所述热启 动DNA聚合酶为PfuTurboCx热启动DNA聚合酶。

3.一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法，其特征在于， 包含下述步骤：

(1)将待测基因组DNA样品片段化，然后对DNA片段进行纯化；

(2)将所述DNA片段进行末端修复，得到经末端修复的DNA片段；

(3)在所述经末端修复的DNA片段的3’端添加碱基A，得到具有甲 基化接头的连接产物；

(4)对所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，回收目的片段；

(5)将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，得到盐处理后的目的片段；

(6)对所述盐处理后的目的片段进行纯化，然后进行PCR扩增，得到 扩增产物：

其中，所述PCR扩增的扩增体系包含下述组份：

超纯水19μl；DNA模板15μl；反应缓冲液5μl；上游引物2.5μl；下 游引物2.5μl；2.5mMdNTP5μl；热启动DNA聚合酶1μl；

(7)分离纯化所述扩增产物，即得到全基因组重亚硫酸盐测序文库。

4.根据权利要求3所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建 方法，其特征在于，所述步骤(1)中的待测基因组DNA样品的用量为5μg 以上。

5.根据权利要求3所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建 方法，其特征在于，所述步骤(1)中的待测基因组DNA来源于细菌或病毒。

6.根据权利要求3所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建 方法，其特征在于，所述步骤(1)中将待测基因组DNA样品片段化时，采 用超声打断仪对待测基因组DNA进行打断。

7.根据权利要求3所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建 方法，其特征在于，所述步骤(4)中采用2％的琼脂糖凝胶电泳的方法对具 有甲基化接头的连接产物进行片段选择。

8.根据权利要求3所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建 方法，其特征在于，所述步骤(6)中对纯化后的目的片段进行PCR扩增时， PCR扩增反应程序为：95℃5分钟；98℃30秒；以98℃10秒、65℃30秒、 72℃30秒为一个循环，进行12个循环；72℃5分钟；最后在4℃下保存。

9.根据权利要求3所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建 方法，其特征在于，所述步骤(7)中采用磁珠法对扩增产物进行分离纯化。

10.根据权利要求3至9中的任一项所述的应用于全基因组重亚硫酸盐 测序的文库构建方法，其特征在于，所述的全基因组重亚硫酸盐测序为采用 高通量测序仪进行的测序。