[发明专利]一种秋水仙素诱导楸叶泡桐同源四倍体的培育方法

说明书

本发明介绍了一种以二倍体楸叶泡桐组培苗的叶片进行的高效楸叶泡桐同源四倍体的诱导培育方法，楸叶泡桐叶片在预培养6 d，附加秋水仙素浓度为30mg·L^‑1，二甲基亚砜的浓度2%，浸泡时间为48 h振荡培养，四倍体楸叶泡桐诱导率达到14.5%；利用染色体计数的方法检测楸叶泡桐变异植株根尖细胞染色体数80，是对应二倍体泡桐的2倍；流式细胞仪检测泡桐四倍体叶片中单细胞DNA含量均是对应二倍体的2倍，表明获得四倍体楸叶泡桐植株。本发明公开的秋水仙素诱导楸叶泡桐同源四倍体培育方法具有取材广泛，操作简单、方便，成本低，诱导率高等优点，对不易获得四倍体的木本植物具有一定的指导意义。

技术领域

本发明属于林木生物技术育种领域，尤其涉及一种秋水仙素诱导楸叶泡桐同源四倍体的培育方法。

背景技术

泡桐（Paulownia）为玄参科泡桐属植物，落叶乔木,现有9个种，2个变种，在我国25个省（市）、自治区均有分布，是我国重要的速生用材林、防护林和平原绿化的主选树种，在改善生态环境和提高农民收入等方面起着重要作用。但泡桐生产中还存在着大冠低干和丛枝病严重等问题，由于泡桐种质资源少，遗传资源匮乏、满足国民经济建设要求的泡桐新品种严重不足，影响了农民种植泡桐的积极性，极大阻碍了泡桐产业的发展。种种事实表明，利用现代生物技术手段培育多倍体是解决目前泡桐新品种不足的有效途径。

多倍体植株具有生物量大，抗逆能力强等优点。随着组织培养和分子生物学的飞速发展，国内外科技人员经过长期不懈的努力，已诱导出多个林木的多倍体，如杨树等树种培育成了林木新品种在生产中得以推广应用。对泡桐来说，二十世纪四十年代，日本学者利用秋水仙素处理毛泡桐种子多倍体的研究工作，但没有变异植株保存下来。二十世纪九十年代，范国强等利用化学诱变结合组织培养技术分别对兰考泡桐、白花泡桐、南方泡桐、豫杂一号泡桐和毛泡桐等进行了四倍体诱导，创制了其新种质，经过大量地繁育和区试工作，已获得‘毛四桐1号’、‘兰四桐1号’、‘白四桐1号’、‘南四桐1号’和‘杂四桐1号’五个国家植物新品种权，并且在林业生产中推广应用，产生了显著的经济、社会和生态效益。但由于楸叶泡桐叶片细胞内含物的种类和数量与其他泡桐存在一定差异，至今未见国内外有关四倍体楸叶泡桐成功诱导的报道。楸叶泡桐是泡桐属中材质较好的一种，利用秋水仙素结合组织培养方法培育其四倍体，不仅对提高楸叶泡桐的生长速度，增强其抗逆性，克服目前楸叶泡桐生产中存在的问题具有重要的实际意义，而且对扩大泡桐的遗传背景、丰富其种质资源也有一定的理论意义。此外，四倍体楸叶泡桐也是培育其三倍体的重要遗传材料。

发明内容

本发明针对目前泡桐研究和生产中存在的问题，提供一种操作简单、方便高效、成本低，诱导率高的楸叶泡桐同源四倍体的培育方法。

本发明采用以下技术方案实现上述目的：

一种秋水仙素诱导楸叶泡桐同源四倍体的培育方法，该方法包括以下步骤：（1）叶片预处理；（2）秋水仙素诱导处理；（3）芽诱导；（4）根诱导；（5）楸叶泡桐变异植株鉴定；（6）四倍体楸叶泡桐幼苗的移栽。

该方法具体步骤如下：

（1）叶片预处理 取楸叶泡桐靠近茎尖处的2~4对叶，将叶片剪成1．0×1．0cm²的方形小块，无菌条件下将其置于MS+0.3 mg/LNAA+14 mg/L BA的固体培养基中，在温度为20±2℃的人工气候箱内黑暗条件下处理4~8d；

（2）秋水仙素诱导处理 无菌条件下将经过步骤（1）预处理后的楸叶泡桐叶片置于含15~45 mg/L秋水仙素和1%~5% 二甲基亚砜的液体培养基中，然后将盛有液体培养基的培养瓶置于振荡培养箱内，25±2℃、黑暗条件下诱导处理24~52 h；