[发明专利]枝孢霉ZF-35及在制备羟化环氧黄体酮中的应用

权利要求书

1.枝孢霉(Cladosporium sphaerospermum)ZF-35，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M 2014399，保藏日期2014年9月5日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

2.一种权利要求1所述枝孢霉ZF-35在制备羟化环氧黄体酮中的应用，其特征在于所述的应用为：以16α,17α-环氧黄体酮为底物，以无水乙醇为反应介质，以枝孢霉ZF-35经发酵培养获得的含菌发酵液为酶源，在25～30℃、160～200rpm下进行转化反应，转化反应结束后，将转化反应液分离纯化，获得羟化环氧黄体酮；所述酶源的用量以含菌发酵液中湿菌体的重量计为0.25～0.8g/mL反应介质，所述16α,17α-环氧黄体酮用量为0.1～0.3g/mL反应介质。

3.如权利要求2所述枝孢霉ZF-35在制备羟化环氧黄体酮中的应用，其特征在于所述酶源按如下步骤制备：

(1)种子培养

将枝孢霉ZF-35接种至种子培养基中，于28℃的恒温培养箱中培养至出现分生孢子，获得种子菌落；

种子培养基终浓度组成：葡萄糖5～15g/L，酵母浸粉1～1.5g/L，蛋白胨1.5～2.5g/L，琼脂15～20g/L，以体积比6:4的人工海水与蒸馏水的混合液为溶剂，pH为4～6；

人工海水终浓度组成:NaCl 24.477g/L、MgCl₂·6H₂O 4.9810g/L、Na₂SO₄3.9170g/L、CaCl₂·H₂O 1.1020g/L、KCl 0.6640g/L、NaHCO₃0.1920g/L、KBr 0.0960g/L、H₃BO₃0.0260g/L、SrCl₂0.0240g/L、NaF 0.0039g/L，溶剂为蒸馏水；

(2)发酵培养

用接种环挑取种子菌落接种于发酵培养基中，放入25～30℃恒温培养箱中，160～200rpm培养至湿菌体含量达到30～60g/L，获得含菌发酵液；

发酵培养基终浓度组成：葡萄糖25～35g/L，玉米浆20～30g/L，硫酸铵1.5～2g/L，酵母粉0.5～1g/L，以体积比6:4的人工海水与蒸馏水的混合液为溶剂，pH为4～6；所述人工海水的组成同种子培养基。

4.如权利要求2所述枝孢霉ZF-35在制备羟化环氧黄体酮中的应用，其特征在于所述转化反应液分离纯化的方法为：转化反应结束后，将转化反应液过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层减压蒸馏获得产物浸膏，再将产物浸膏进行硅胶柱层析，分别以体积比1:4的乙酸乙酯和石油醚混合液，体积比1：3的乙酸乙酯和石油醚混合液、体积比1:2的乙酸乙酯和石油醚混合液、体积比1:1的乙酸乙酯和石油醚混合液、无水乙酸乙酯为洗脱液进行梯度洗脱，TLC跟踪检测，收集洗脱剂为体积比1:2的乙酸乙酯和石油醚混合液对应的流出液，得到转化产物1；收集体积比1:1的乙酸乙酯和石油醚混合液对应的流出液，得到转化产物2；收集无水乙酸乙酯对应的流出液，得到转化产物3，分别干燥，获得三种羟化环氧黄体酮。

5.如权利要求2所述枝孢霉ZF-35在制备羟化环氧黄体酮中的应用，其特征在于所述酶源的用量以含菌发酵液中湿菌体的重量计为0.25～0.6g/mL反应介质，所述16α,17α-环氧黄体酮用量为0.1～0.2g/mL反应介质。

6.如权利要求2所述枝孢霉ZF-35在制备羟化环氧黄体酮中的应用，其特征在于所述种子培养基组成为：葡萄糖7～12g/L，酵母浸粉1.1～1.3g/L，蛋白胨1.7～2.2g/L，琼脂17～21g/L，以体积比6:4的人工海水与蒸馏水的混合液为溶剂，pH为4～5。

7.如权利要求2所述枝孢霉ZF-35在制备羟化环氧黄体酮中的应用，其特征在于所述发酵培养基组成为：葡萄糖27～30g/L，玉米浆22～27g/L，硫酸铵1.7～1.9g/L，酵母粉0.6～0.9g/L，以体积比6:4的人工海水与蒸馏水的混合液为溶剂，pH为4～5；所述人工海水的组成同种子培养基。