[发明专利]一种以乙酸为原料合成甲羟戊酸的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种以乙酸为原料合成甲羟戊酸的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

甲羟戊酸是生物体内生成异物烯焦磷酸(IPP)的中间代谢产物，是合成甾醇、萜类、类异戊二烯的重要中间体，同时，在化工行业也有重要的用途。目前，甲羟戊酸合成主要有酶法合成、生物催化和化学催化相结合合成、化学合成等方法，但存在步骤繁琐、收率过低或不适于产业化制备等问题。经微生物发酵合成甲羟戊酸，反应条件温和，环境友好，可很好的解决以上问题。

目前生物法合成甲羟戊酸，主要以葡萄糖为碳源，经过糖酵解，产生丙酮酸；丙酮酸在丙酮酸脱氢酶系的作用下生成乙酰辅酶A；乙酰辅酶A进入甲羟戊酸代谢途径，在乙酰乙酰-辅酶A硫解酶，HMG-CoA合酶及HMG-CoA还原酶的催化剂下生成甲羟戊酸。研究者已经在大肠杆菌内过表达乙酰乙酰-辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因(mvaE)以及HMG-CoA合酶基因(mvaS)，以葡萄糖为碳源进行发酵，最终甲羟戊酸产量能够达到47g·L^-1(Tabata et al.,Biotechnology Letters 26,1487-1491,2004)。然而，由于葡萄糖成本较高，限制了生物法的广泛应用，寻找更廉价的碳源，降低生物法制备甲羟戊酸的成本是现有技术亟待解决的问题。

乙酸作为一种价廉易得的可替代碳源，从工业废液中回收乙酸，作为工程大肠杆菌的碳源，发酵生产甲羟戊酸，既可回收利用资源,又可减轻环境污染，同时还能降低生产成本，具有广阔的应用前景。乙酸在大肠杆菌体内的代谢途径，有2种代谢方式，一是以由乙酰辅酶A合成酶(ACS)催化生成乙酰辅酶A，一是由乙酸激酶(ACK)和磷酸转乙酰酶(PTA)催化生成乙酰辅酶A(Alan J.Wolfe,Microbiol.Mol.Biol.Rev.2005,69(1):12-50)。但目前尚没有利用乙酸发酵生成甲羟戊酸的菌株报道，以乙酸为原料生物合成甲羟戊酸是否可行尚无法确定。

发明内容

为解决以葡萄糖为原料生产甲羟戊酸成本过高的问题，本发明提供了一种以乙酸为原料合成甲羟戊酸的基因工程菌，所采取的技术方案如下：

本发明的目的之一在于提供一种以乙酸为原料合成甲羟戊酸的基因工程菌，该基因工程菌是共表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因mvaE和HMG-CoA合酶基因mvaS，同时过表达乙酰辅酶A合成酶基因asc和苹果酸酶基因meaB。

上述基因可来源于化学合成、扩增自微生物或扩增自重组质粒。

优选地，所述乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因meaB，来源于枯草芽孢杆菌、烟曲霉菌或大肠杆菌。

优选地，乙酰辅酶A合成酶基因acs来自大肠杆菌的，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因meaB，来自大肠杆菌的，Gene ID：12931931。

本发明的另一目的在于提供了一种所述基因工程菌的构建方法，该方法的步骤如下：

1)获得乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因mvaE、HMG-CoA合酶基因mvaS、乙酰辅酶A合成酶基因asc和苹果酸酶基因meaB；

2)构建含有乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因mvaE和HMG-CoA合酶基因mvaS的重组质粒；

3)构建含有乙酰辅酶A合成酶基因asc和苹果酸酶基因meaB的重组质粒；

4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到宿主菌中，获得基因工程菌。

所述方法中乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因meaB，来源于枯草芽孢杆菌、烟曲霉菌或大肠杆菌。

所述方法中所述乙酰辅酶A合成酶基因acs优选来源于大肠杆菌的，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因meaB优选来源于来自大肠杆菌的，Gene ID：12931931。

所述方法的具体步骤如下：

1)获得乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因mvaE、HMG-CoA合酶基因mvaS、乙酰辅酶A合成酶基因asc和苹果酸酶基因meaB；

所述乙酰辅酶A合成酶基因acs，优选来自大肠杆菌，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因meaB，优选来自大肠杆菌，Gene ID：12931931；

2)将步骤1)所得乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因mvaE和HMG-CoA合酶基因mvaS克隆到质粒载体pACY-Duet上，构建重组质粒pACY-mvaE-mvaS；