[发明专利]一种里氏木霉突变菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物筛选技术领域，具体涉及一种里氏木霉突变菌株及其应用。

背景技术

里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种丝状真菌，属于多细胞的真核微生物，是红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性型，分类上隶属于真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、木霉属。里氏木霉广泛分布于自然界，在腐木、种籽、植物残体、有机肥、土壤和甚至是空气中(Montenecourt& Eveleigh,1979,Adv Chem Ser.)。

里氏木霉能表达多种胞外纤维素酶和半纤维素酶，包括外切纤维素酶(CBH1和CBH2)、内切纤维素酶(EG1、EG2、EG3、EG4和EG5等)、beta-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶等。通过这些纤维素酶和半纤维素酶的协同作用，将纤维素彻底分解为单糖(Biely & Tenkanen.1998,In Trichoderma and Gliocladium)，因此，木霉产纤维素酶已经是二代纤维素生物乙醇的主要酶制剂来源。

但成本过高已经成为限制纤维素乙醇产业化开发的关键，尤其纤维素酶的成本。当前，每吨纤维素的成本中，纤维素酶的成本超过了2000元。因此筛选高产纤维素酶的菌株是降低生产乙醇成本的关键因素之一。而影响木霉纤维素酶表达的因素很多。首先，培养碳源的影响：纤维素，乳糖和槐糖用来诱导木霉产纤维素酶；葡萄糖和甘油等阻遏纤维素酶的表达。碳源的诱导作用是调控因子来影响表达的，如与诱导表达相关的正调控因子是ACEII和XYR1，而负调控因子是CRE1和ACEI(Ilme′n et al.,1997,Mol.Gen.Genet.；Foreman et al.,2003,J.Biol.Chem.)。其次，菌体(菌丝)形态也是影响分泌表达的关键因素之一。一般认为，丝状真菌是通过顶端分泌来输出胞外蛋白的。因此，高效分泌菌株形态上往往是多分枝的。

然而从自然界中直接筛选到的木霉菌株产酶水平往往很低，不适合商业生产。因此，如何通过现有技术改造木霉菌株提高其胞外蛋白含量，以降低生产成本就成为本领域的研究热点之一。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种里氏木霉突变菌株及其在产纤维素酶方面的应用。所述突变菌株是通过辐射诱变的方法获得的，能高产纤维素酶，进而有效降低纤维素酶的生产成本，有利于其广泛应用。

本发明一方面提供了一株里氏木霉(Trichoderma reesei)突变菌株LA2-7，已于2014年11月12日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2014564。

本发明还提供了上述里氏木霉突变菌株在纤维素酶生产中的应用。

本发明还提供一种生产纤维素酶的方法，是用上述的里氏木霉突变菌株发酵来制备的；

用于发酵的培养基的组成为葡萄糖15.0g/L、乳糖16.0g/L，玉米浆25.0ml/L，(NH₄)₂SO₄ 5.0g/L，MgSO₄ 1.0g/L，KH₂PO₄ 20g/L，CaCl₂ 0.4g/L，吐温-80 0.2ml/L，微量元素 0.2ml/L，聚丙二醇-2000 0.2ml/L，NaOH 1.0g/L,pH值5.0。其中微量元素溶液(g/L)的组成为：CuSO₄·5H₂O0.048mol/L，FeSO₄·7H₂O 0.18mol/L，CoCl₂·6H₂O 0.034mol/L，MnCl₂·4H₂O 0.08mol/L。

本发明利用辐射诱变技术获得一株高产纤维素酶的里氏木霉突变菌株LA2-7，该突变株LA2-7发酵上清液酶活为3282U/mL，比出发菌提高了276％，蛋白含量为12.2g/L，比出发菌提高了237％。此外，突变株LA2-7的菌落明显小于出发菌，且菌丝比出发菌的菌丝粗、短，分枝多，有利于在生产过程中降低发酵菌液的粘度，进而可以降低搅拌速度，提高溶氧，能有效降低生产成本，应用前景广泛。

附图说明

图1：出发菌和突变菌的菌落形态比较，其中：A为出发菌L-10，B为突变菌LA2-7；