[发明专利]大泷六线鱼卵黄原蛋白夹心ELISA试剂盒及其制备方法、检测方法及应用

权利要求书

1.一种检测大泷六线鱼卵黄原蛋白的夹心ELISA试剂盒，包括一个盒体，盒体内有空白96孔酶标板1块，封闭液、包被液、洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液各1支，其特征在于该盒体还装有：大泷六线鱼卵黄原蛋白纯品1支，兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支、辣根过氧化物酶标记的兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支。

2.如权利要求1所述的检测大泷六线鱼卵黄原蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于，

所述的包被液为50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液；

洗涤液为含质量分数是0.05% Tween-20的150mM pH7.4的磷酸盐缓冲液；

封闭液为含质量分数是2% BSA的pH7.4的磷酸盐缓冲液；

样品稀释液为含质量分数是0.05% Tween-20、1% BSA的150mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.4； 

显色液为TMB单组分显色液；

终止剂为2 M H₂SO₄水溶液。

3.如权利要求1所述的检测大泷六线鱼卵黄原蛋白的间接ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)制备大泷六线鱼卵黄原蛋白纯品；

2)利用步骤1）得到的大泷六线鱼卵黄原蛋白纯品制备兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白抗体；

3)利用步骤2)制得的兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白抗体制备辣根过氧化物酶标记的兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白多克隆抗体；

4)将步骤1)得到的大泷六线鱼卵黄原蛋白纯品1支、步骤2)得到的兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白抗体1支、步骤3)得到辣根过氧化物酶标记的兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支，以及包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液各1支放入盒内，得到检测大泷六线鱼卵黄原蛋白的夹心ELISA试剂盒。

4.如权利要求3所述的检测大泷六线鱼卵黄原蛋白的间接ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的大泷六线鱼卵黄原蛋白纯品的制备方法如下：

采用肌肉注射17β-雌二醇(17β-estradiol，E₂)的方式诱导大泷六线鱼产生卵黄原蛋白；注射一周后取血，4℃，5000 g离心10分钟，收集上清液；向上清中加入等体积的饱和硫酸铵溶液，冰浴条件下摇晃2小时后离心，向沉淀中加入pH 7.5、25mM Tris-HCl，使沉淀重新溶解；进一步的纯化采用1.5′ 20 cm的 Sephadex G-200层析柱，加入1 ml上述溶液，用pH 7.5的25mM Tris-HCl 洗层析柱，收集第一个洗脱峰，即为大泷六线鱼卵黄原蛋白。

5.如权利要求3所述的检测大泷六线鱼卵黄原蛋白的间接ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白多克隆抗体的制备方法如下：

取600 μg纯化的大泷六线鱼卵黄原蛋白，加入等体积的弗氏完全佐剂，对大白兔进行背部皮下多点注射，两周后再次加强免疫，免疫剂量为600μg/只，用弗氏不完全佐剂充分乳化后进行背部皮下注射；此后，每隔10天按以上方法进行加强免疫；于每5次注射5天后从心脏取血，6000 g离心20分钟，收集上清，获得了兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清；向抗血清中加入等体积的PH 7.4 0.02 mol/L磷酸缓冲液；在冰浴条件下加入硫酸铵，至50%饱和度，0℃震荡2h后，低温离心，8000 g、15min，弃上清，沉淀用10ml 0.02mol/L磷酸缓冲液溶解；以0.02mol/L磷酸缓冲液透析24h；用0.45微米孔径的滤膜过滤后，上Hitrap Protein G柱，随后以0.02 mol/L磷酸缓冲液洗脱10个柱体积，然后以pH2.7、0.1M甘氨酸洗脱抗体，即获得兔抗大泷六线鱼卵黄原蛋白多克隆抗体。