[发明专利]一种非抗性筛选KISS1真核表达质粒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因疫苗领域。具体涉及一种非抗性筛选KISS1真核表达质粒，含有该真核表达质粒的重组大肠杆菌，以及该重组大肠杆菌在制备动物免疫去势基因疫苗中的应用，本发明还涉及一种动物免疫去势基因疫苗的制备方法。

背景技术

家畜去势术在我国具有久远的历史，最早记载于夏代《夏小正》中，把对公畜去势称为攻驹或攻特。目前，家畜去势方法还主要沿用手术阉割。中国家畜年出栏量巨大，其中包括6亿头猪和3亿头羊(米春改.全国畜牧业发展概况.中华人民共和国年鉴,2012)。畜牧生产中主要对公畜去势，母畜基本不去势。每年大约就有3亿头公猪和1亿头公羊采取手术去势，工作量巨大，成本很高，而且易感染。同时，规模化标准化生产中动物福利、成本控制、熟练劳动力稀缺等新需求和新形势迫使开发方便高效，成本低廉的去势新技术和新方法。在众多去势方案中，激素免疫去势在规模化标准化大生产中最有应用潜力。免疫去势的技术关键在于免疫靶标的选择。激素免疫去势主要以下丘脑-垂体-性腺轴中的生殖激素成员为靶标(靶基因或靶蛋白)。GnRH、FSH和LH是免疫去势常用的靶标(韩燕国，等.动物GnRH-I免疫去势的研究进展.生理科学进展,2013,44(5):399-401；姜勋平,等.基因免疫原理和方法.北京:科学出版社,2004)。FSH或LH蛋白疫苗免疫后在抑制动物睾酮分泌、精子发生和精液品质上均有一定的抑制效果(Falvo RE,等.Effect of active immunization against LHRH or LH in boars:reproductive consequences and performance traits.J Anim Sci,1986,63(3):986-94；Ferro VA.Current advances in antifertility vaccines for fertility control and noncontraceptive applications.Expert Rev Vaccines,2002,1(4):443-52)。但是，它们的共同问题是免疫动物后抗体水平不高，去势效果不明显。于是，研究者除了寻找改善免疫效果的方法外，更多地将研究视角转向生殖轴的上一级成员GnRH。兽用GnRH蛋白疫苗(如Improvac和Bopriva)已经可以达到去势的目的(Brunius C,等.Early immunocastration of male pigs with Improvac()-effect on boar taint,hormones and  reproductive organs.Vaccine,2011,29(51):9514-20)。但是，这种蛋白型去势疫苗操作复杂，成本高。鉴于此，研究者构建了低成本的GnRH基因疫苗用于动物免疫去势，试验结果表明受免小鼠雄激素水平降低、睾丸萎缩和精子发育受阻等(叶文剑等.GnRH基因疫苗构建及免疫去势效果评价.武汉：华中农业大学图书馆,2012；Khan MAH,等.Immunisation with a plasmid DNA vaccine encoding gonadotrophin releasing hormone(GnRH-I)and T-helper epitopes in saline suppresses rodent fertility.Vaccine,2008,26(10):1365-1374；Khan MAH,等.Immunisation of male mice with a plasmid DNA vaccine encoding gonadotrophin releasing hormone(GnRH-I)and T-helper epitopes suppresses fertility in vivo.Vaccine,2007,25(18):3544-53)，但没有完全抑制精子的发生。因此，为了使开发的基因疫苗达到免疫去势的目的，必须提高基因疫苗在机体内表达效率或寻找新的免疫去势靶标。KISS1由下丘脑分泌，处于生殖轴控制的最上游，通过控制GnRH的分泌起到繁殖控制开关的决定性作用，将其敲出或突变后严重降低了动物的繁殖性能(Suzuki S,等.Direct kisspeptin-10stimulation on luteinizing hormone secretion from bovine and porcine anterior pituitary cells.Animal Reproduction Science,2008,103(3-4):360-5；Clarke IJ,等.Kisspeptin stimulates ovulation in seasonally acylic ewes.In Proc 89th Annual Meeting of the Endocrine Society.Toronto，Ontario，Canada,2007；Lapatto R,等.Kiss1-/-mice exhibit more variable hypogonadism than Gpr54-/-mice.Endocrinology,2007,148(10):4927-36)。对于免疫去势疫苗的靶标而言，下丘脑-垂体-性腺轴上游的激素成员用于免疫去势的效果上游要比下游的好，例如GnRH免疫去势效果就比FSH或LH的好。由此推论，用处于生殖轴最上游的KISS1基因免疫去势效果可能比GnRH还好。为此，需进一步用基因免疫的新方法展开KISS1新靶标免疫去势效果的研究。