[发明专利]一种盐生杜氏藻中微量元素含量测定方法

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种盐生杜氏藻中β-胡萝卜素和叶绿素a含量测定方法。

背景技术

盐生杜氏藻Dunaliella salina为双鞭毛单细胞绿藻，广布于内陆盐湖，可耐高盐度(20-300‰)，个体较大(16-24μm×10-13μm)，因能大量合成β-胡萝卜素(最高可达干重的14％)而受到广泛重视。β-胡萝卜素是人体内维生素A的前体，可用于防治癌症、心血管病及老年性痴呆等退行性疾病，还能作为高级天然色素用于食品加工。临床试验表明，盐生杜氏藻提取的盐藻素对调节血压、降低血脂、降血糖、糖尿病、酒精肝、脂肪肝、胃溃疡、胃炎、白内障、夜盲症、干眼病有较好疗效且可明显提高机体免疫力。目前，澳大利亚、以色列、美国、中国、日本、西班牙、加拿大等已有几十家公司从事盐生杜氏藻生产。我国具有漫长的海岸线和星罗棋布的内陆盐湖，具有培养盐生杜氏藻生产β-胡萝卜素得天独厚的自然条件。

β-胡萝卜素含量是衡量盐生杜氏藻质量好坏的最重要指标，藻液中β-胡萝卜素含量的测定一直是一个麻烦、费时、费事、费力、令人头疼的工作。以前，邓同乐发明了一种β-胡萝卜素提取物中β-胡萝卜素含量的定量检测方法(专利号CN201410235214)，具体步骤是：1)将β-胡萝卜素标准品用石油醚-异丙醇混合液稀释成系列浓度的标准品溶液；2)称取待测的β-胡萝卜素提取物溶于石油醚-异丙醇混合液中，作为样品溶液；3)将步骤1)所得的标准品溶液和步骤2)所得的样品溶液分别进行高效液相色谱分析；从而分别获得系列浓度的标准品溶液以及样品溶液中β-胡萝卜素的吸收峰面积比；4)建立β-胡萝卜素标准曲线；5)将样品溶液中胡萝卜素的峰高代入步骤4)所得的曲线方程中，从而最终得知待测的β-胡萝卜素提取物中β-胡萝卜素的含量。该方法结果准切可靠，测试费用低，但耗时长，设备昂贵，操作繁琐，技术要求高，效率低。

关于海藻中叶绿素测定方法，过去黄廷林曾公开了一种水生藻类叶绿素测定方法(专利号200410073542)，该方法用分光光度法测定水中藻类叶绿素含量，采用醋酸纤维微孔滤膜过滤水中藻类，用90％乙醇浸泡研磨截留了藻类的醋酸纤维膜，将藻类细胞中的叶绿素萃取到乙醇中，将萃取液离心获得澄清液，以90％乙醇作参比，用分光光度计测定萃取液在630、647、664、750nm处的吸光度，利用测定数据计算水样中叶绿素a、b、c的含量。刘春光也发明了一种水中浮游藻类叶绿素a的测定方法(专利号200610129454)，其原理和具体操作步骤与黄廷林的发明相近。他们的发明测定结果准确稳定，重现性好，安全无污染，但缺点也很明显，操作麻烦，技术性强，对测试人员要求高，设备昂贵，仪器投资大，实用性不强。

为了克服传统方法的缺点，我发明了一种萃取法测定盐生杜氏藻中β-胡萝卜素和叶绿素a含量方法，该法操作简便，技术性要求不高，耗时短，结果准确，费用低，可一次完成多个样品的测定。

发明内容

为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种盐生杜氏藻中β-胡萝卜素和叶绿素a含量测定方法，方法如下：

β-胡萝卜素含量的测定方法

步骤1将盐生杜氏藻培养至第13天时，藻细胞密度可达到250×10⁴-400×10⁴cell/每毫升，用移液管移取藻液100毫升，装入250毫升的三角烧瓶中；

步骤2加入15克NaCl，加入80％乙二醇(由乙二醇和蒸馏水按80∶20体积比混合而成)120毫升，保鲜膜封口，橡皮筋扎紧，放在摇床上摇匀20分钟，充分萃取；

步骤3此时液体分成上清液和下浊液，用20毫升的移液管移取上清液，加入到250毫升的容量瓶中，用80％乙二醇定容至250毫升；

步骤4转入250毫升圆底烧瓶中，在摇床上摇匀60分钟，用721型分光光度计测定在波长425nm时的吸光值OD₄₂₅，用下式计算β-胡萝卜素含量

β-胡萝卜素含量(mg/L)＝(最后定容体积×9.84×OD₄₂₅)÷(2.91×藻液取样体积)

最后算出的β-胡萝卜素含量单位是(mg/L)，即每升藻液中含有的β-胡萝卜素毫克数。叶绿素a含量的测定方法

步骤5将盐生杜氏藻培养至第9天时，藻细胞密度可达到150×10⁴-300×10⁴cell/每毫升，用量筒取藻液200毫升藻液，倒入500毫升的三角烧瓶中；