[发明专利]一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法

权利要求书

1.一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

S1. MDBK细胞的培养

将长满单层的MDBK细胞，用胰酶消化后，加入生长液制成细胞悬液以2～4×10⁵个/ml的密度接种于96孔板，每孔100μl，置于37℃ 5% CO₂的条件下培养，24h后细胞贴壁铺满孔底；其中，所述生长液为含有10%马血清的MEM培养基；

S2. BVDV的接种

用步骤S1培养的MDBK细胞接种BVDV，添加含2%的马血清至每孔200μl，培养72h，同时设不接种BVDV的MDBK细胞作为阴性对照；

S3. 间接免疫荧光检测牛病毒性腹泻病毒

    S31.洗涤： 将灭菌预冷的PBS洗去96孔板细胞残留的生长液，洗涤2～3次，每次4～6min；

    S32.丙酮固定：用丙酮固定30～60min，PBS冲洗洗涤2～3次，每次4～6min；

    S33. 一抗孵育：用PBS稀释羊抗牛BVDV多克隆血清一抗，湿盒37℃孵育45～90min，PBS冲洗洗涤2～3次，每次4～6min；

    S34. 二抗孵育：再用PBS稀释兔抗羊IgG FITC二抗，湿盒37℃孵育45～90min，PBS冲洗洗涤2～3次，每次4～6min；

    S35. 结果判定：将96孔板放在倒置显微镜上观察，判定结果。

2.如权利要求1所述的一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于，步骤S1中所述长满单层MDBK细胞的培养方法为：MDBK细胞在细胞培养瓶中培养，生长液为含有10%马血清的MEM培养基，在 37℃ 5% CO₂的恒温培养箱中培养，2～3天传代一次，长满单层MDBK细胞。

3.如权利要求1所述的一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于，步骤S32中所述丙酮温度为0～10℃，浓度为50%～80%。

4.如权利要求1所述的一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于，步骤S33中所述羊抗牛BVDV多克隆血清一抗的稀释倍数为50～400倍。

5.如权利要求1所述的一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于，步骤S34中所述兔抗羊IgG FITC二抗的稀释倍数为为50～800倍。