[发明专利]一种蚯蚓血细胞涂片的制作方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种土壤污染生态毒理诊断涂片的制作方法，特别是涉及一种蚯蚓血细胞涂片的制作方法。

背景技术

土壤生态系统中，蚯蚓是最重要的栖息者之一。蚯蚓在土壤的形成过程中，在土壤结构和土壤肥力的保持等方面具有独特的作用，蚯蚓能够改善土壤的通气、保水和排水，提高土壤的养分循环速度，调节土壤微生物区系的组成，改善土壤生态系统的功能。另外，蚯蚓在陆地生态系统中具有特殊地位，很多动物鼠、鸟类等可以摄食蚯蚓，从某种意义上，它连接了土壤圈与大气圈，沟通了土壤生物同地上生物之间的联系。

在土壤污染生态毒理诊断研究中，由于蚯蚓分布广泛，对土壤污染胁迫比较敏感，蚯蚓成为目前土壤污染状况检测的重要生物指标之一，以及许多生态毒理国际标准中推荐使用的模式生物。在有关蚯蚓的毒性研究中，大多是以不同污染状态下蚯蚓生存、生长和繁殖的响应指标（如蚯蚓急性致死率和慢性体质量抑制率）为研究对象，检验土壤污染的状况。但随着土壤污染生态毒理诊断研究的深入，这些指标已经不能满足低剂量污染条件下土壤生态毒理诊断的需要，而蚯蚓遗传毒理学方面的研究逐渐成为污染指标的研究热点。

微核法是国际上公认的致癌危险性及其他遗传危害的短期测试的有效方法,而在蚯蚓血细胞微核实验中最主要也是最关键的步骤就是蚯蚓血涂片的制作。在血涂片的制作方面，大多集中于脊椎动物和植物，对无脊椎动物却不多见，尤其是体型较小的蚯蚓，而且蚯蚓血细胞涂片制作的好坏直接影响血细胞的形态观察及鉴定结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蚯蚓血细胞涂片的制作方法，该方法能准确、快速的取到蚯蚓的血液，并能制作出薄而且均匀的血涂片，所使用的染色剂亦能将蚯蚓血细胞内的细胞均匀染色，染色效果良好，能清晰地观察到蚯蚓血细胞内的各种细胞，为土壤污染生态毒理诊断提供方法和技术支持。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

1.一种蚯蚓血细胞涂片的制作方法，所述方法包括以下制作过程：

a、蚯蚓取血：将具环带的活体蚯蚓用蒸馏水洗净后，放入培养皿中逐滴加入无水乙醇进行麻醉，3分钟后，用镊子触碰蚯蚓，待其不作出反应后取出，并用滤纸吸去蚯蚓表面的水分，然后用手术剪刀在蚯蚓环带下方且靠近环带的腹部将腹血管剪破，使血自然流出，勿挤压，取洁净的载玻片，让血滴在离载玻片一端4~5毫米处，勿触及蚯蚓体表；

b、涂片：取一块边缘光滑的载玻片做推片，并将其置于血滴的前方，向后移动并触及血滴，待血均匀附着于两玻片之间时，使两玻片呈30~45度的角度，向另一端以一定的速度平稳地推出，角度要保持不变，用力均匀地推出血膜，自然晾干；

c、染色：将Giemsa（姬姆萨）染液滴在血膜上，至染液淹没全部血膜，染3分钟后，加等量pH值为7.17的磷酸盐缓冲液与染液混合再染10分钟，用洗耳球轻轻吹动，使染液与缓冲液混合均匀，最后用蒸馏水把染液冲掉，用滤纸吸去多余的水，自然风干后，即可观察；

d、显微镜观察：将制好的血涂片放在显微镜上观察，观察时显微镜的倍数由低到高，即可清晰地观察到蚯蚓血细胞内各种细胞的形态。

本发明的优点与效果是：

    本发明能准确、快速的取到蚯蚓的血液，并能制作出薄而且均匀的血涂片，所使用的染色剂亦能将蚯蚓血细胞内的细胞均匀染色，染色效果良好，能清晰地观察到蚯蚓血细胞内的各种细胞。该发明还有简便、稳定、易于操作等优点，将在蚯蚓血细胞微核检测方面发挥重要作用。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步详述。

实施例1

1、蚯蚓取血：将具环带的活体赤子爱胜蚯蚓用蒸馏水洗净后，放入培养皿中逐滴加入无水乙醇进行麻醉，3分钟后，用镊子触碰蚯蚓，待其不作出反应后取出，并用滤纸吸去蚯蚓表面的水分，然后用手术剪刀在蚯蚓环带下方且靠近环带的腹部将腹血管剪破，使血自然流出，勿挤压，取洁净的载玻片，让血滴在离载玻片一端4毫米处，勿触及蚯蚓体表。

2、涂片：取一块边缘光滑的载玻片做推片，并将其置于血滴的前方，向后移动并触及血滴，待血均匀附着于两玻片之间时，使两玻片约呈30度的角度，向另一端以一定的速度平稳地推出，角度要保持不变，用力均匀地推出血膜，自然晾干。

3、染色：将Giemsa（姬姆萨）染液滴在血膜上，至染液淹没全部血膜，染3分钟后，加等量pH值为7.17的磷酸盐缓冲液与染液混合再染10分钟，用洗耳球轻轻吹动，使染液与缓冲液混合均匀，最后用蒸馏水把染液冲掉，用滤纸吸去多余的水，自然风干后，即可观察。