[发明专利]抗Ki67蛋白单克隆抗体及其用途

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCC No.9574)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体UMAB107。本发明还涉及单克隆抗体UMAB107在制备用于检测Ki67蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体UMAB107的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体UMAB107在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与Ki67蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了Ki67蛋白免疫检测的特异性和可靠性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及可特异结合Ki67蛋白的单克隆抗体UMAB107，产生所述单克隆抗体的细胞株，及应用该抗体用于诊断的方法和用途。

背景技术

Ki67是一种大分子蛋白质，存在于细胞核内，由两条肽链组成，相对分子量分别为345kDa和395kDa。Ki67抗原是1983年由Gerdes等人确定的，他们首次利用霍奇金淋巴系IA28细胞核对小鼠进行免疫，制备出了Ki67抗体。由于当时的实验地点为德国的城市kiel，并且由于Ki67抗体所用的组织培养板编号是67号，故被命名为Ki67。1993年，Schluter等得出其氨基酸序列，发现他包含有40个弱的和10个强的PGST区(富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸)。 PGST区很不稳定，是蛋白容易降解的部位，故Ki67对蛋白酶非常敏感，这使 Ki67的半衰期比较短，约为lh，所以Ki67不容易被分离、提取。

Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关。Ki67 可以识别除G0期以外的G1、S、G2和M期的细胞。Ki-67增殖指数高低与许多肿瘤的分化程度、浸润、转移以及预后密切相关。Ki67在细胞增殖中是不可缺少标记，是目前已知的增殖抗原中最具增殖能力代表性、应用最广泛的增殖细胞标记之一。因此广泛用于各种恶性肿瘤的标记，在恶性肿瘤早期诊断、治疗及选择方法、治疗疗效的评估和判断预后中存在巨大潜力。

Ki67作为增殖标记物抗原在疾病，特别是肿瘤的研究中有广阔的应用前景，是目前国内外研究的热点。在乳腺癌方面的研究中，健康乳腺组织可以表达Ki67的水平很低(<3％的水平)，乳腺癌的Ki67表达大约为78％。在乳腺癌中，肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移、病理分期等临床病理因素对于乳腺癌患者预后的影响很大。Ki67能可靠反映出乳腺正常组织和病变组织的增殖活性，Ki67还可以通过与ER、PR、053、C.erbB-2的联合检测，更好地评估乳腺癌的生物学行为及增殖活性，可以更精确的帮助临床医师进行乳腺癌的高危、复发和转移因素的分析，为临床个体化治疗提供更多的理论依据。

目前临床上通常通过免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤细胞中Ki67 的表达状况。IHC实验的核心为特异性结合Ki67的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对Ki67蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的Ki67蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测Ki67蛋白的免疫检测工具中的应用。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2014年8月22日，保藏编号为CGMCC No.9574。

本发明还提供了一种特异性结合Ki67蛋白的单克隆抗体UMAB107，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：通过基因合成的方式合成Ki67的第1160-1493 位氨基酸的核苷酸序列并引入酶切位点SgfI、MluI，通过SgfI和MluI两个酶切位点将目的序列连接到载体pET23a-N-His上，构建Ki67重组表达质粒；