[发明专利]一种西尼罗病毒的微流体基因芯片检测方法在审
| 申请号： | 201410653174.8 | 申请日： | 2014-11-17 |
| 公开（公告）号： | CN104498618A | 公开（公告）日： | 2015-04-08 |
| 发明（设计）人： | 田桢干;王传现;周启明;赵百慧;李深伟;章琪;张子龙 | 申请（专利权）人： | 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93 |
| 代理公司： | 上海泰能知识产权代理事务所31233 | 代理人： | 黄志达 |
| 地址： | 200135上*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 西尼罗 病毒 流体 基因芯片 检测 方法 | ||
1.一种西尼罗病毒的微流体基因芯片检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)样本混匀处理；
(2)RNA核酸提取；
(3)RT-PCR扩增反应：
a.RT-PCR反应体系包括：RT-PCR反应液,特异性正、反向引物混合液，逆转录酶/DNA聚合酶，DEPC水,RT-PCR质控品,样本RNA核酸；
b.将RT-PCR反应液加入已固化特异性探针的芯片内，将芯片放入反应室内进行扩增反应；
所述的特异性引物和探针是根据Envelope基因特异性引物扩增区内设计，能够区别其他病毒株，特异性引物和探针为：
WNV-F:5-CAGACCACGCTACGGCG-3(SEQ ID NO 1)
WNV-R:5-CTAGGGCCGCGTGGG-3(SEQ ID NO 2)
WNV-Probe:5-TCTGCGGAGAGTGCAGTCTGCGAT-3(SEQ ID NO 3)
(4)杂交：RT-PCR扩增完后，加入杂交反应液，使杂交液和扩增液都进入到杂交舱内进行杂交反应；
(5)清洗：杂交后的芯片用洗液冲洗，直接用荧光扫描仪检测；
(6)结果判定：根据杂交结果，判定感染情况。
2.根据权利要求1所述的西尼罗病毒的微流体基因芯片检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的RNA提取可使用病毒RNA提取试剂盒提取；所述的RNA提取步骤为:取140ul血液样本，裂解后，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取RNA。
3.根据权利要求1所述的西尼罗病毒的微流体基因芯片检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述的PCR反应体系为：2X RT-PCR反应液12.5ul,引物混合液2.5ul，14mM MgSO42.5ul，PCR Grade H2O 1ul,逆转录酶/DNA聚合酶1ul,PCR Control 2ul,Sample 3.5ul。
4.根据权利要求1所述的西尼罗病毒的微流体基因芯片检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述的RT-PCR扩增的反应条件是：50℃逆转录20min；95℃预变性2min；95℃变性10s，60℃退火40s，72℃延伸50s；11个循环，每个循环退火温度降低1℃，直至退火温度变成50℃；95℃变性15s，56℃退火40s，72℃延伸50s，40个循环。
5.根据权利要求1所述的西尼罗病毒的微流体基因芯片检测方法，其特征在于：步骤(4)中所述的杂交反应条件是：95℃预变性3min；58℃杂交30min。
6.根据权利要求1所述的西尼罗病毒的微流体基因芯片检测方法，其特征在于：步骤(5)中所述的清洗条件是3000rpm，离心2min。
7.根据权利要求1所述的行性乙型脑炎病的微流体基因芯片检测方法，其特征在于：步骤(3)所述的PCR扩增与步骤(4)所述的杂交在芯片仪上完成。
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