[发明专利]一种基孔肯雅病毒的微流体基因芯片检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种基孔肯雅病毒的快速微流体基因芯片检测方法。

背景介绍

随着全球经济一体化和贸易自由化，国外的医学媒介生物通过先进的交通工具和国际贸易，可以迅速把传染病从一个国家或地区传向全球，造成国际间传播。近年来,新发病毒性传染病在世界各国频频暴发流行,对人类健康带来严重威胁,给社会造成巨大经济损失。这些新发病毒性传染病的频发给我们敲响了警钟,加强对其的研究和监测以及早预防控制是至关重要的。

虫媒病毒是一类通过吸血节肢动物叮咬敏感脊椎动物宿主而在人畜之间进行传播的病毒，其中100多种可以导致人畜疾病，严重者会导致死亡。基孔肯雅热是由基孔肯雅病毒引起，是披膜病毒科甲病毒属。基孔肯雅热的特征是突然发热，经常伴有关节痛。其他常见征兆和症状还包括肌肉疼痛、头痛、恶心、疲劳和皮疹。关节疼痛通常使患者极为虚弱，但往往持续数天或延长至数周。基孔肯雅热发生在非洲、亚洲和印度次大陆。以发热、皮疹及关节疼痛为主要特征的急性传染病。本病主要流行于非洲和东南亚地区，近年在印度洋地区造成了大规模流行。埃及伊蚊和白纹伊蚊是本病的主要传播媒介。主要通过感染病毒的伊蚊叮咬而传播。人对基孔肯雅病毒普遍易感，感染后可表现为显性感染或隐性感染。人感染数量在非洲已多年相对比较低，但在1999-2000年间，在刚果民主共和国发生了一次大暴发，2007年加蓬发生了一次暴发。自2005年起，基孔肯雅热大范围流行发生在印度洋各群岛。欧洲很多输入性病例与这次流行有关。自2005年起，印度、印度尼西亚、泰国、马尔代夫和缅甸已经报告了超过190万病例。随着我国商贸、旅游业的快速发展,境内外人员交往日益密切,以及动物的进口等影响,基孔肯雅病毒输入的危险性日益增高。因此,尽快建立快速简便、特异敏感的检测方法对防范基孔肯雅病毒的输入具有重要意义。

基因芯片采用微加工和微电子技术将大量的人工设计好的基因片段有序地、高密度地排列在纤维膜等载体上。基因芯片可以同时固定大量的探针分子，可以在一次实验中检出多种病原体；同时检测的灵敏度、特异性和快速便捷性也很高，因而在病原体分析检测中有很好的应用前景。

本发明整合了逆转录聚合酶链式反应RT-PCR和微阵列Microarray这两种强大的分子生物学技术，将RT-PCR与微阵列芯片杂交反应舱整合到一张芯片上，PCR杂交的探针直接固定

在微阵列中的杂交舱中。操作简单，节省时间，灵敏度高，特异性好。为基孔肯雅病毒的检测提供了快速，简便，灵敏的微流体基因芯片检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏的基孔肯雅病毒微流体基因芯片检测方法。通过本发明可大幅度提高出入境口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止外来输入性传染病的发生。

本发明提供的基孔肯雅病毒微流体基因芯片检测方法，包括如下检测步骤：

(1)样本混匀处理；

(2)RNA核酸提取；

(3)RT-PCR扩增反应：

a.RT-PCR反应体系包括：RT-PCR反应液,特异性正、反向引物混合液，逆转录酶/DNA聚合酶，DEPC水,RT-PCR质控品,样本RNA核酸；

b.将RT-PCR反应液加入已固化特异性探针的芯片内，将芯片放入反应室内进行扩增反应；

所述的特异性引物和探针是根据E2基因特异性引物扩增区内设计，能够区别其他病毒株，特异性引物和探针为：

CHIKV-F:5-AAGCTYCGCGTCCTTTACCAAG-3(SEQ ID NO 1)

CHIKV-R:5-CCAAATTGTCCYGGTCTTCCT-3(SEQ ID NO 2)

CHIKV-Probe:5-CCAATGTCYTCMGCCTGGACACCTTT-3(SEQ ID NO 3)

(4)杂交：RT-PCR扩增完后，加入杂交反应液，使杂交液和扩增液都进入到杂交舱内进行杂交反应；

(5)清洗：杂交后的芯片用洗液冲洗，直接用荧光扫描仪检测；

(6)结果判定：根据杂交结果，判定感染情况。

步骤(2)中所述的RNA提取可使用病毒RNA提取试剂盒提取。取140ul血液样本，裂解后，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取RNA。