[发明专利]一种前交叉韧带残端来源的间充质干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种前交叉韧带残端组织来源的间充质干细胞的分离方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取前交叉韧带残端组织，剪成组织碎块，采用浓度为0.2～0.6％(w/v)的I型胶原酶溶液消化4～6h；

(2)终止消化，用100～400目筛网过滤，1000～2000rpm离心4～10min，弃上清，PBS洗涤3次，重悬于间充质干细胞培养基中，置于37℃、5％CO₂条件下培养，2～3天后弃去非贴壁细胞和碎片，换液，此后每3～4天换液一次，在细胞融合度为80％～90％时收获细胞，即可。

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(1)中，所述组织碎块的体积为1～5mm³。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(1)中，所述消化是在37℃、30～300转/分条件下振荡消化。

4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(1)中，所述I型胶原酶溶液的浓度为0.2％(w/v)；所述I型胶原酶溶液是包含胶原酶的低糖DMEM培养基。

5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，所述终止消化的方法是：加入细胞悬液1/2～3倍体积的含10％FBS的低糖DMEM培养基。

6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，所述筛网为200目筛。

7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，所述离心的转速为1200rpm，离心时间为5min。

8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，细胞培养时，环境的相对湿度为95％。

9.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，所述间充质干细胞培养基是添加有10％FBS，3.7g/L NaHCO₃，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，25ng/ml两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培养基。

10.权利要求1～9任意一项方法分离得到的间充质干细胞。