[发明专利]一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法

说明书

本发明公开了一种L‑天冬氨酸β‑脱羧酶产生菌的高通量筛选方法。该方法包括如下步骤：1)采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离；2)然后将平板分离得到的单菌落接种96微孔板初筛半固体培养基，初筛得到L‑天冬氨酸β‑脱羧酶产生菌；3)对初筛得到的菌株接种24孔板液体培养，结合纸层析法复筛得到L‑天冬氨酸β‑脱羧酶高产菌株；4)对复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵，结合氧化显色法确认酶活性。本发明方法适用于L‑天冬氨酸β‑脱羧酶产生菌的高通量筛选，筛选的菌株具有耐碱性能，在细胞生产过程中避免了繁琐pH值控制步骤。同时也为同类生物酶产生菌的高通量筛选提供参考。

技术领域

本发明属于微生物制药领域，涉及一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法。

背景技术

L-天冬氨酸β-脱羧酶(Asd)，又称L-天冬氨酸1-脱羧酶，能催化脱去L-天冬氨酸的羧基，生成L-丙氨酸(L-Ala)。L-丙氨酸在医药和食品工业上的应用相当广泛，随着需求量的增加和发酵工业的发展，L-丙氨酸的生产方法由蛋白质水解提取法、发酵法发展到酶法生产，即利用L-天冬氨酸β-脱羧酶将L-天冬氨酸脱羧生成L-丙氨酸。用Asd转化生产L-Ala可分为游离细胞法和固定化细胞转化法。日本已经在1982年用卡拉胶固定Pseudomonas.dacunhae细胞用于L-Asp连续生产L-Ala。国内刘景晶等(参见高丽娟等人于2007年在《工业微生物》37(5)：54-59中发表的文章)用卡拉胶固定含有Asd活性的Pseudomonas.dacunhae细胞，在pH6.2～pH7.25范围内和底物浓度为0.4mol/L-0.5mol/L时，固定化细胞表现出最高酶活力。

然而在L-丙氨酸酶法转化过程中，脱羧反应使反应液pH值不断上升，偏离了酶反应的最适pH值范围，导致细胞的酶活力降低，这对工艺过程控制和生物反应器提出更高要求。由于海洋微生物具有陆生微生物无法比拟的生态群落结构多样性和物种多样性，所以从海洋环境中筛选具有特殊耐受性质的生物酶产生菌是目前微生物领域研究的特点，本发明基于该理念，建立了从海洋生境中快速筛选L-天冬氨酸β-脱羧酶的高通量方法，并且筛选的菌株具有耐碱性能，在细胞生产过程中避免了繁琐pH值控制步骤。

发明内容

本发明的目的是提供一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法。

本发明所提供的L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法，具体而言，可包括如下步骤：

1)采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离；

2)将步骤1)分离得到的单菌落穿刺接种微孔板初筛半固体培养基，培养后根据培养基的浑浊程度筛选L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌；

3)将步骤2)初筛得到的菌株接种微孔板液体培养，收集菌体进行生物转化，采用纸层析法分析生成的L-丙氨酸含量，得到L-天冬氨酸β-脱羧酶高产菌株；

4)将步骤3)复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵培养，收集菌体进行生物转化，然后氧化显色法测定L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活性。

在上述方法中，步骤1)中，所述微生物样品来自海绵、珊瑚、海底淤泥，所述富集培养基含有质量百分含量1％-2％的NaCl；

步骤2)中，所述初筛半固体培养基含有质量百分含量0.05％的CaCl₂；

步骤3)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤2)初筛得到的菌株接种到复筛培养基，20℃-37℃恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20℃-37℃孵育12-24小时；

步骤4)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤3)复筛得到的菌株接种到摇瓶发酵培养基，20℃-37℃恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20℃-37℃孵育12-24小时；