[发明专利]一种培养结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种培养结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的方法。

技术背景

结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)简称甘蓝，在中国又称为包菜、圆白菜、洋白菜、卷心菜等，是十字花科芸薹属中最重要的蔬菜作物之一。甘蓝为异花授粉植物，杂种优势十分明显。但是，作为绿体春化植物，受条件的限制，一般一年只能自交繁殖一代，育成一个稳定的自交系至少需要5～6年的时间。游离小孢子培养是快速获得纯合双单倍体的最佳方法之一，对加快农作物的新品种选育，提高育种效率具有重要作用。此外，游离小孢子培养还可应用于遗传图谱构建、诱变、基因转化、突变体筛选等的研究。同时，小孢子胚胎诱导和发育作为一种研究细胞全能性及胚胎发育的模式体系也引起越来越多的关注。

在芸薹属植物中，30～35℃热激预处理被作为游离小孢子培养中诱导胚胎发生的一个先决条件。目前结球甘蓝游离小孢子培养使用的诱导胚胎发生的胁迫条件为30～35℃热激24～48h后再置于25℃培养，在此基本培养体系下，已有较多胚胎诱导成功的报道。但是，许多基因型胚胎发生率还是很低，尤其是一些农艺性状重要的基因型在小孢子胚胎形成时表现出顽抗性，限制了该技术在甘蓝育种中大规模应用。同时，相较于其他作物小孢子培养的植株再生率，结球甘蓝胚状体的植株再生较为困难。

发明内容

本发明的目的在于针对现有结球甘蓝小孢子培养体系存在的胚胎发生率、植株再生频率低的问题，提供一种由结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的新方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种培养结球甘蓝游离小孢子获得再生植株的方法，包括以下步骤：

(1)胚胎发生

1)供体材料选取：选取健康结球甘蓝植株处于单核后期的花蕾为供体花蕾；

2)供体材料灭菌；

3)小孢子的分离、分装；

4)小孢子胚状体的诱导培养：将上一步分离出的小孢子置于18±0.5℃培养箱中暗培养，直至有肉眼可见的胚状体产生；

5)子叶胚形成：将小胚状体转到25±0.5℃、黑暗、50～55rpm摇床上震荡培养，至子叶胚状体形成；

(2)胚萌发和再生植株的获得

1)胚萌发在6000lx光照14h/d、25±0.5℃条件下，将子叶胚转接在胚萌发固体培养基上于培养皿中进行培养，直至胚萌发；

2)植株再生2～3周后，转入植株再生固体培养基上，于三角瓶中继续培养1–2周长成幼苗。

所述的小孢子的分离、分装方法优选：将灭菌后的花蕾放入无菌研钵中，加入小孢子提取培养基，用研棒轻轻挤压，使小孢子从花药中游离到溶液中，45μm孔径的尼龙筛网过滤，收集滤液，100×g离心3次，每次3min；最后1次离心后，弃上清，将小孢子沉淀悬浮在胚状体诱导培养基中，调整小孢子密度为1×10⁵个/mL，于每个无菌玻璃培养皿(Φ60mm)中分装2mL悬浮液，并加入100μL 1％的活性炭，Parafilm封口。

所述的小孢子提取培养基配方为：B5+蔗糖130g/L+甘露醇7g/L，pH5.8。

所述的胚状体诱导培养基配方为：NLN+蔗糖130g/L+阿拉伯半乳糖12mg/L，pH6.0。

所述的小孢子胚状体的诱导培养步骤中优选将上一步分装后的小孢子悬浮液置于18±0.5℃培养箱中暗培养，直至有肉眼可见的胚状体产生。

所述的胚萌发固体培养基配方为：B5+蔗糖20g/L+琼脂10g/L+6-BA 0.15mg/L，pH 5.8。

所述的植株再生固体培养基配方为：B5+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

供体材料灭菌方法优选先用纯净水清洗花蕾，然后在超净工作台中用体积比75％酒精消毒30s，之后用体积比7％的次氯酸钠溶液表面消毒15min，再用无菌水冲洗3次，每次5min。

有益效果

本研究以结球甘蓝为材料，建立了高效的游离小孢子培养胚胎发生与植株再生体系，为结球甘蓝育种、细胞、基因工程等的研究奠定了基础。本发明提供的一种高效获得结球甘蓝游离小孢子培养再生植株的新方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：