[发明专利]I-TevIN201-Cas9null融合蛋白及其应用

说明书

技术领域

    本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种I-TevI_N201-Cas9_null融合蛋白及其应用。

背景技术

CRISPR-Cas源自细菌和古细菌的免疫系统，可利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行修饰。RNA导向Cas9可以在多种细胞和生物体中发挥功能，在特异位点裂解完整基因组。Cas9这种基因组编辑的潜能使这项技术已经广泛用于人的细胞系，小鼠，大鼠，多物种的基因敲除及敲入。

I-TevI是一种归巢酶，它有N末端的催化结构域，中间的链接区域和C末端的DNA结合域构成。该酶序列特异性的识别CNNNG序列。

特异性的gRNA靶向的Cas9基因敲除技术已经有了比较广的应用，但是该技术存在很大的不足，就是脱靶效应。为了提高打靶的特异性，有很多改进，比如选择多个gRNA打靶，然后进行脱靶效应分析，此外，还有用两个突变型的Cas9即 Cas9 nickase，用两个gRNA引导Cas9 nickase去进行切割。还有的科学家用失活的Cas9即Cas9_null，连接一个ForkI蛋白（Cas9_null-ForkI），对特定基因位点进行修饰，但是仍然存在脱靶效应。为了最大程度上提高其特异性，我们用失活的Cas9即Cas9_null和特异性识别CNNNG序列的I-TevI_N201蛋白融合，形成一个gRNA靶向的，特异性切割CNNNG序列工具酶，该工具酶可以对基因组进行精确的基因编辑。

发明内容

解决的技术问题：

本发明的目的在于克服现有技术的不足提供一种I-TevI_N201-Cas9_null融合蛋白，即将I-TevI_N201的N端201氨基酸和Cas9_null（没有切割活性）的N端融合。该蛋白在gRNA的引导下，可以序列特异性的切割CNNNG位点，达到精确切割基因组的作用，使产生的脱靶效应大大降低。

技术方案：

I-TevI_N201-Cas9_null融合蛋白，所述融合蛋白为由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白。

所述的I-TevI_N201-Cas9_null融合蛋白的核苷酸序列。

以上所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的I-TevI_N201-Cas9_null融合蛋白，其第十位天冬氨酸突变成丙氨酸，第839位组氨酸突变成丙氨酸，第840位组氨酸突变成丙氨酸，第863位天冬酰胺突变成丙氨酸，该突变蛋白没有核酸酶活性。

所述的I-TevI_N201-Cas9_null融合蛋白，其中I-TevI_N201蛋白由归巢酶I-TevI N末端201个氨基酸组成，包含I-TevI的酶的催化活性区域和连接域。

所述的I-TevI_N201-Cas9_null融合蛋白在药物筛选及基因修饰中的应用。

所述的I-TevI_N201-Cas9_null融合蛋白的基因可以克隆到真核表达载体上，用于细胞和动物的基因修饰。

有益效果

本发明通过将I-TevI_N201的N端201氨基酸和Cas9_null（没有切割活性）的N端融合，得到一种I-TevI_N201-Cas9_null融合蛋白，该蛋白在gRNA的引导下，可以序列特异性的切割CNNNG位点，达到精确切割基因组的作用，从而使细胞的脱靶效应大大降低；此外利用本发明所得I-TevI_N201-Cas9_null融合蛋白做药物筛选或基因修饰时更安全，该蛋白还可用于基因治疗。