[发明专利]一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒，其特征是：所述的检测试剂盒包含一对Kappa阿片受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，所述的一对Kappa阿片受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物：

所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：

5’-GTGGGTTTGGTGGGTAAT-3’；

所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：

5’-Biotin-CTCTTCTAAAAAACCACCCTATAACAT-3’；

所述的甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列：

5’-GGTTTGGTGGGTAATT-3’。

2.根据权利要求1所述的一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：其特征是：包括以下步骤：

步骤一：提取样本的全血基因组DNA，并检测所得DNA的浓度；

步骤二：采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；

步骤三：取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo Taq^TM PreMix酶，并加入一对Kappa阿片受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增；

步骤四：焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM甲基化特异性测序引物的退火缓冲液，将需要使用的混匀的琼脂糖珠转移到一个微量离心管中，在琼脂糖珠中加入结合缓冲液混匀；将以上混合液加入PCR扩增产物中，将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液和120ml的变性缓冲液；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具移到PCR板中，抓取琼脂糖珠；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5至10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有甲基化特异性测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃ 2分钟，再冷却到室温；

步骤五：焦磷酸测序：在焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒对步骤四中的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析。

3.根据权利要求2所述的一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：所述的步骤一中采用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪提取全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度。

4.根据权利要求2所述的一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：所述的步骤二中采用EZ DNA甲基化试剂盒。

5.根据权利要求2所述的一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：所述的步骤三中PCR扩增条件为：首先95℃ 10min的变性；接着95℃ 30s，Tm 40s，72℃ 50s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃ 7min。

6.根据权利要求2所述的一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：所述的步骤五中焦磷酸测序仪采用PyroMark Q24焦磷酸测序。