[发明专利]一种提取人肿瘤细胞膜蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品领域，具体的说是提供一种人肿瘤细胞膜蛋白的提取方法。

技术背景

细胞膜是细胞对外界的屏障和细胞内外环境交流的界面，它使细胞与周边环境隔离，维持着相对稳定的细胞内环境。膜蛋白是细胞膜的重要组成部分，执行着细胞内外物质交换、细胞识别与免疫应答、信号转导和调控，以及能量传递等重要功能。在基因组中，编码膜蛋白的基因约占基因总数的三分之一。在已知的药物靶标中，大约有70％是膜蛋白，包括G蛋白偶联受体，离子通道蛋白，转运蛋白，细胞色素P450等。关于膜蛋白的动态观察和表征对深入理解生理过程，疾病机制和药物靶点的筛选具有十分重大的意义。

膜蛋白的异常表达和修饰与肿瘤细胞的恶性行为密切相关。信号受体如离子通道偶联受体、G蛋白偶联受体、酪氨酸激酶受体等的异常可以激活或启动一系列生物化学反应，在肿瘤的发生、发展和转移过程具有关键作用。膜转运蛋白如载体蛋白发现与肿瘤的抗药性有非常密切的关系。细胞黏附蛋白作为一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互作用的蛋白，在肿瘤转移过程发挥重要作用。由上可见，肿瘤细胞中膜蛋白的研究对探索肿瘤细胞的形成机制，筛选肿瘤标志物和药物靶点都是非常重要的。

对于肿瘤细胞膜蛋白的研究，膜蛋白的分离纯化是研究的基础和起点。由于大多数膜蛋白是低丰度蛋白、具有很强的疏水性，这些特点给膜蛋白的提取纯化带来了挑战。当前膜蛋白的提取方法通常使用表面活性剂、超声波破碎、蔗糖梯度密度离心、差速梯度离心、生物素化等方法。在膜蛋白的研究过程中，表面活性剂对膜蛋白的提取、纯化以及稳定膜蛋白的生物活性具有非常重要的作用。目前，研究膜蛋白的表面活性剂有SDS、Triton X-100、NP-40、OG、CHAPS等等。然而，这些表面活性剂由于自身的特点，在膜蛋白质组学的具体应用中具有各自的局限性，如对膜蛋白增溶性不好，不能有效稳定膜蛋白的生物活性，或者不兼容后续的酶解和质谱鉴定等。对称型表面活性剂(Gemini surfactant)是一类具有对称结构的二聚型双亲分子。近年来，在膜蛋白体系的研究中崭露头角。为膜蛋白科学的研究提供新型的分子工具。

发明内容

针对现有技术的缺乏和不足之处，本发明提供一种人肿瘤细胞膜蛋白的提取方法。

本发明通过以下方案实现：一种提取人肿瘤细胞膜蛋白的方法，按照以下步骤进行：1.对所收集的人肿瘤细胞使用10mmol/L Tris-HCl溶液中，于冰上使用Dounce匀浆器匀浆；

2.匀浆液在4℃以4000rpm的离心后收集上清液，沉淀为未破碎细胞及细胞核；

3.细胞上清液在4℃以14400rpm离心后收集上清液，沉淀为线粒体；

4.细胞上清液在4℃以35300rpm离心后收集沉淀，上清液为细胞浆溶液；

5.沉淀用膜蛋白裂解液于冰上裂解；使用的膜蛋白裂解液组成有效成分为7mmol/L尿素，2mmol/L硫脲，4％对称型表面活性剂化合物，40mmol/L DTT；

6.经过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜超滤处理后，分装。

步骤(1)中使用Dounce匀浆器的细胞破碎方法。

步骤(4)中使用离心条件为35300rpm离心60分钟。

步骤(6)中使用截留分子量为3000道尔顿的超滤膜。

步骤(5)中的对称型表面活性剂的结构为：

或

有益效果

1、采用Dounce匀浆器冰上对人肿瘤细胞进行破碎，其收集膜蛋白组分的纯度要远远高于超声波破碎，主要原因是由于采用差速离心分离不同的细胞器，其原理是通过不同细胞器自身的密度差异进行分离纯化，匀浆器通过机械方法破碎细胞，能够较好地保存各种细胞器的完整性，可以通过差速离心纯化密度不同的细胞，达到良好的分离效果。而超声波破碎是通过高频的交变水压强，使空气膨胀爆炸，将细胞击碎。这种破碎方式不仅彻底破碎细胞，也将亚细胞器打碎，达不到良好的亚细胞器分离效果，为膜蛋白组分带来其他细胞器的杂质。

2、膜蛋白裂解液采加入对称型表面活性剂化合物1和2，其溶解膜蛋白的效果要明显优于其他商品化表面活性剂，如OG、DDM和CHAPS。与传统的表面活性剂相比，对称型表面活性剂具有更高的表面活性和更为优良的物理化学性质，如超低界面张力、低临界胶束浓度、Krafft点等。其中，低临界胶束浓度的特点让对称型表面活性剂在水溶液中非常容易聚集形成胶束，对膜蛋白具有更强的增溶作用，从而提高溶解膜蛋白的效率。