[发明专利]植物叶片中琥珀酰丙酮的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析检测技术，具体涉及一种检测植物叶片中是否有琥珀酰 丙酮积累的方法。

背景技术

酪氨酸降解途径在动物中是必不可少的，在动物新陈代谢中占有十分重 要的地位，若酪氨酸途径被中断或堵塞将会导致严重的代谢紊乱。Lindblad 等人发现在遗传性酪氨酸血症患者体内红细胞内的胆色素原合酶的活性不到 正常活性的5％，而胆色素原合酶在肝细胞内的活性只有正常活性的1％。酪氨 酸代谢的紊乱导致中间代谢产物的累积，从而致使人体内的肝和肾受到严重 损伤。Ruppert等人发现延胡索酰乙酰乙酸酶基因发生突变的纯合突变体小鼠 在出生后不久便死亡，死亡的原因是不能激活肾和肝细胞内具有激素依赖性 糖原异生所需要的相关的酶，同样，它的直接原因也是酪氨酸降解途径的紊 乱。

人类中若酪氨酸降解途径中断会引发I型遗传性酪氨酸血症病 (HereditaryTyrosinaemiatypeI，HT1)。HT1的病因是酪氨酸降解途径中 的最后一个酶——延胡索酰乙酰乙酸酶(fumarylacetoacetatehydrolase， FAH)发生突变造成的，它是一种先天性遗传病，主要影响的器官是肝脏，影 响的范围是从肝硬化到肝癌。除此之外，还造成肾小管损伤和急性神经系统 损坏。对于这个病的诊断主要是依靠检测患者体内琥珀酰丙酮 (succinylacetone，SA)的含量。

琥珀酰丙酮是生物体内二十种基本氨基酸之一的酪氨酸非正常代谢的产 物。酪氨酸正常代谢生成二氧化碳和水，当代谢过程中一种重要的酶，延胡 索酰乙酰乙酸酶缺乏时，酪氨酸代谢受阻，其中间产物马来酰乙酰乙酸和延 胡索酰乙酰乙酸会在生物体内大量积累并转化成琥珀酰丙酮，最终产生毒害 作用，因此，生物体内琥珀酰丙酮含量的检测是判断生物是否发生酪氨酸代 谢紊乱的重要依据。

酪氨酸代谢紊乱多见于人和动物，并且已有了较为成熟的人和动物体液 中琥珀酰丙酮的分析方法。植物体内发生酪氨酸代谢紊乱的现象虽也有报导， 但由于缺乏植物中琥珀酰丙酮的分析技术，尚无法确认，相关研究也因此而 滞后。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术中尚没有关于检测植物体 内是否含有琥珀酰丙酮的方法的不足，提供一种植物叶片中琥珀酰丙酮的检 测方法，以判断植物是否有琥珀酰丙酮的积累。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种植物叶片中 琥珀酰丙酮的检测方法，该方法步骤如下：

a、浸取：取叶片，液氮研磨后置于过量的pH值为11-13、摩尔浓度为 10mol/L的NaOH溶液或KOH溶液中，超声提取10-15min，超声频率为35-45MHZ， 再于冰浴下浸泡1-2小时，浸泡液在5-7℃下离心，采用0.22μm滤膜过滤； 其中，离心转速为9500-10500r/min，时间为18-22min。

b、异恶唑化：于上述滤液中，按每20ml滤液加2.8-3.2ml质量体积浓 度为10g/L的盐酸羟胺水溶液的比例，加入盐酸羟胺水溶液，在55-65℃下水 浴40-80min，常温下离心，采用0.22μm滤膜过滤；其中，离心转速为 3500-4500r/min，时间为3-7min。

c、转移溶剂：按每20ml滤液加2.4ml摩尔浓度为12mol/L的浓盐酸的 比例，于b步骤所得滤液中加入浓盐酸(目的是让水相变为酸性，方便接下 来将琥珀酰丙酮萃取到有机相中)，再按每20ml滤液加10mL、8mL、5mL色谱 纯级的乙酸乙酯的比例，依次加入乙酸乙酯萃取，合并有机相；

d、硅烷化：将上述有机相旋转蒸发，蒸发后的溶液体积是每4g叶片原 料得1-3ml，入氮气吹干仪吹近干，即保证不被完全吹干，接近干燥即可(使 用氮气吹，一方面是降低液面溶剂蒸汽压，使溶剂加快蒸发；另一方面是氮 气不活泼，隔绝氧气，能保护目标物)，按每4g叶片原料加175-225ul硅烷 化试剂的比例加入硅烷化试剂(BSTFA:TMCS＝99:1)，于60-70℃下水浴 85-95min，；再入氮气吹干仪吹干后，按每4g叶片原料加40-120ul色谱纯级 乙酸乙酯的比例加入色谱纯级乙酸乙酯溶解样品瓶中固体，进行GC-MS分析， 并与琥珀酰丙酮标准品配制成的溶液在该GC-MS分析条件下得到的琥珀酰丙 酮标准品的出峰时间和特征峰进行比较。