[发明专利]直接凝血酶抑制剂多肽及其用途

说明书

本申请为发明名称：直接凝血酶抑制剂多肽及其用途，

申请号：201310127718.2，申请日：2013年4月14日的分案。

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种抗凝多肽及其用途，尤其是直接凝血酶抑制剂的多肽及其用途。

背景技术

现有技术公开了直接凝血酶抑制剂(DTIs)的研制和开发在预防和治疗静脉和动脉血栓、肝素诱导的血小板减少症(HIT)及急性冠脉缺血性综合症等心脑血管病发挥了巨大的作用。与传统的抗凝剂(肝素(heparin)和维生素K(VKAs))相比，所述DTIs具有明显的优势；目前已知，已有注射用DTIs及口服DTI用于临床治疗。然而，实践显示，上述注射用DTIs及口服DTI药物的适应症尚属单一，其中的每种DTI仅针对特定的病症，且治疗费用昂贵；因此，开发新型注射用和口服用DTIs，在治疗和预防血栓栓塞疾病方面具有广阔前景。

本申请的发明人在之前研制了新型双功能融合蛋白RGD-hirudin具有抗凝血酶、抗血小板聚集的双重功能，属一类生物技术新药，现已进入I期临床研究阶段；但由于所述RGD-Hirudin为一种蛋白质/多肽类药物，作为一种直接凝血酶抑制剂只能通过静脉注射的给药方式用药，明显限制了其临床使用范围。

因此，本申请的发明人拟提供一种新型的直接凝血酶抑制剂的多肽，所述多肽应具有抗凝活性，抗凝作用温和、可控，且药物作用靶点明确，对其它凝血因子没有作用，能制备口服或皮下缓释抗凝药物。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗凝多肽及其用途，尤其是直接凝血酶抑制剂的多肽。所述多肽具有抗凝活性，抗凝作用温和、可控，且药物作用靶点明确，对其它凝血因子没有作用。

本发明的抗凝多肽能制备预防血栓性疾病药物，所述药物尤其可制成口服或皮下缓释抗凝药物。

本发明中，通过对RGD-hirudin结构功能研究，确定重组双功能水蛭素与凝血酶相互作用关系，即RGD-hirudin的C末端与凝血酶exosites I结合，N末端与凝血酶活性位点结合，抑制凝血酶活性；然后，以RGD-hirudin的序列(“一种新型双功能水蛭素及其制备方法和应用”，2006年，中国发明专利，专利号：01105798.X)为基础，保留其功能氨基酸残基，采用分子模拟软件提供了具有抗凝活性的多肽Peptide 1和Peptide 2。

所述多肽Peptide 1的序列如SEQ ID NO:1所示；

所述多肽Peptide 2的序列SEQ ID NO:2所示。

本发明中，所述的多肽Peptide 1和Peptide 2为在RGD-Hirudin的结构基础上，对其进一步改造，将该分子截短，形成小分子多肽；

本发明中，利用毕赤酵母表达，经纯化、质谱分析结果显示，Peptide 1的理论分子量为3924.6730Da(35肽)，Peptide 2的理论分子量为4023.7275Da(36肽)；

本发明中，Peptide 1经HPLC测定的纯度为82％，Peptide 2经HPLC测定的纯度为84％；所述Peptide 1蛋白含量为32mg，Peptide 2蛋白含量为40mg；

本发明中测定了所述多肽的抗凝血酶活性，结果显示，所述Peptide 1抗凝血酶比活性为7000ATU/mg，所述Peptide 2抗凝血酶比活性为6000ATU/mg；

本发明进行了动物实验，结果显示，所述Peptide 1和Peptide 2在aPTT在用药后延长，比用药前延长1倍左右，抗凝作用持续2h后，逐步恢复正常。

上述结果表明，所述多肽Peptide 1和Peptide 2可作为凝血酶直接抑制剂，具有抗凝血酶活性，其药物作用靶点明确，对其它凝血因子没有作用，可进一步制备口服或皮下缓释抗凝药物；本发明所述的凝血酶直接抑制剂药物能克服现有口服抗凝药物存在的出血、血小板减少、导致抗凝治疗失败的缺陷，可用于预防血栓性疾病；

本发明所述多肽还可作为DTIs的候选药物进行深入研究，为开发出新型DTIs奠定基础。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1显示了本发明所述的多肽Peptide 1建模和Ramachandran图谱分析结果，