[发明专利]一种东亚飞蝗ATP合酶α亚基基因及其dsRNA在害虫防治中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种ATP合酶α亚基基因、dsRNA及其在东亚飞蝗防治中的应用。

背景技术

害虫严重危害农业生产，由于长期施用有机氯、有机磷等化学杀虫剂，导致一系列问题：农药残留导致环境污染严重；有毒农药危害人类身体健康；昆虫出现抗药性，防治成本提高等。目前已有将生物杀虫剂应用于害虫防治，但杀虫时间较长，杀虫效果不稳定，因此迫切需要新型的害虫防治方法。

RNA干扰(RNAi)是一种通常由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象，于2006年获得诺贝尔奖。这一发现不仅为基因的功能研究提供了方法上的突破，同时也为人类的疾病治疗和害虫防治开辟了新的途径。2008年，Price和Gatehouse总结了众多实验结果后，提出来基于RNAi的害虫防治策略。基于RNA干扰技术的害虫防治具有如下优势：1)选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和人类是安全的；2)抗虫具有专一性，对靶标生物无杀伤作用；对环境无毒无害。

发明内容

本发明的目的是提供一种核酸分子，可以编码东亚飞蝗ATP合成酶α亚基的基因，并作为药物靶点，使蝗虫致死。

一种核酸分子，其特征在于：序列为SEQ ID NO.1及其互补序列。

优选地，上述核酸分子中，SEQ ID NO.2序列及其互补序列可以作为有效的药物靶点，干扰基因的转录表达。

本发明的另一目的在于针对上述核酸分子，提供有效干扰其转录表达的dsRNA(双链核糖核酸)。

RNA构建体，其包含至少一个双链RNA区，其至少一条链包含与上述任一核酸分子互补的核苷酸序列。

上述RNA构建体，其中所述至少一个双链RNA区至少具有17bp。

优选地，RNA构建体，其序列为SEQ ID NO.3或其互补序列。

DNA构建体，包含了上述核酸分子，或者包含编码上述RNA构建体的区域。

表达构建体，包含了上述DNA构建体。

宿主细胞，包含上述RNA构建体、DNA构建体或表达构建体。

杀虫组合物，包含了上述RNA构建体和/或上述DNA构建体和/或上述表达构建体和/或上述宿主细胞以及适合的载体。

上述任一项RNA构建体和/或DNA构建体和/或表达构建体和/或宿主细胞以及适合的载体和/或杀虫组合物在防治蝗虫中的应用。

有益效果

1.本发明获得了蝗虫的ATP合成酶酶α亚基eDNA的保守序列，并构建其RNA、DNA等构建体沉默了蝗虫体内ATP合酶α亚基，经验证体内ATP合酶α亚基的表达明显受到抑制，并导致蝗虫产生致死效应，本发明可应用于RNAi技术对东亚飞蝗害虫防治。

2.本发明用于防治蝗虫尤其是东亚飞蝗，种属特异性强，不会对其它物种造成干扰，如蜜蜂、人等；本发明基因特异性强，不会对除ATP合酶或α亚基之外的基因产生干扰影响。

3.本发明防治蝗虫具有高效性，尤其是东亚飞蝗，剂量小(dsRNA用量为100ng)，起效快(处理2天左右导致蝗虫致死)。

附图说明

图1：五龄飞蝗注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA后的致死情况。

图2：五龄飞蝗注射序列为SEQ ID NO：3合成的dsRNA后ATP合酶α亚基基因(LmATPSA)的不同时间点mRNA表达，RP49做为内参基因。12，24，36h为注射dsRNA后的小时数。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。以下实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：飞蝗ATP合酶α亚基基因及其dsRNA的获得

i、飞蝗ATP合酶α亚基基因的获得

1)飞蝗ATP合酶α亚基基因在飞蝗EST数据库的搜索

基于飞蝗的EST数据库，采用生物信息学方法对飞蝗ATP合酶α亚基基因进行搜索，经过序列拼接及比对后，共获得1条飞蝗ATP合酶α亚基基因。

2)飞蝗ATP合酶α亚基基因引物的设计

基于已获得LmATPSB的碱基序列，采用primer premier5.0软件设计引物。所有引物均由南京金思瑞生物有限公司合成。

3)飞蝗总RNA获得

选取大小一致雌雄各半飞蝗5龄若虫，3头一组，冷冻于液氮中，待提取RNA，具体操作步骤参照TRIzol(Invitrogen)说明书。

4)第一链cDNA的合成

参照PromegaM-MLV反转录酶试剂说明书，进行第一链cDNA的合成。