[发明专利]马铃薯致病疫霉二酰甘油酰基转移酶基因DGAT2-4及其应用

说明书

(一)发明领域

本发明涉及马铃薯致病疫霉二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,DGAT)DGAT2-4及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。

(二)技术背景

马铃薯致病疫霉能够导致马铃薯和番茄等重要农作物发生晚疫病，但其菌丝体中三酰甘油(triacylglycerol,TAG)含量高，并含有丰富的长链多不饱和脂肪酸(Yen,Stone et al.2008；Sun,Liu et al.2013)。马铃薯致病疫霉基因组测序完成，为克隆、鉴定马铃薯致病疫霉TAG合成途径相关基因及进一步的基因工程应用奠定了基础。

三酰甘油由3分子脂肪酸和1分子甘油酯化而成，是脂肪酸和能量的储藏库，普遍存在于植物、动物和真菌中。TAG除作为重要的食用油外，还是重要的化工原料。

近年来，通过植物和微生物生产的TAG来替代原油被作为一种可持续的绿色环保能源而受到人们的重视。TAG合成途径主要有两条，依赖酰基CoA的途径和不依赖酰基CoA的途径。依赖酰基CoA的途径又称为Kennedy途径，以酰基CoA作为底物在甘油骨架上进行连续的酰化反应。

DGAT是一种跨膜蛋白(细胞溶质DGAT除外)，在依赖酰基CoA的Kennedy途径中催化TAG合成的最后一步反应，将酰基CoA底物加到Sn-1,2-二酰甘油的Sn-3的位置上形成三酰甘油，是植物中储存油脂积累的限速步骤(Ichihara,Takahashi et al.1988；Sebei,Ouerghi et al.2006)。DGAT超表达能够增加拟南芥种子中油脂的含量(Xu,Francis et al.2008)。另外，在大豆、油菜、玉米中也有同样的结果(Jako,Kumar et al.2001；Zheng,Allen et al.2008；Lock,Snyder et al.2009)。

克隆、鉴定新的DGAT基因，对利用转基因技术，在植物或微生物中过量表达高催化活性的DGAT酶，从而提高植物或微生物中含油量具有重要的意义。

本发明在马铃薯致病疫霉中克隆到1个编码DGAT的cDNA序列，在DGAT基因的突变体酿酒酵母中诱导表达这个基因，发现其编码产物能够利用油酸(oleic acid,OA)合成TAG，证明了其具有二酰甘油酰基转移酶活性。

(三)发明内容

本发明利用同源克隆的方法，从马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)中克隆到了1个DGAT基因的cDNA全长序列，其编码的氨基酸序列与其它物种中已鉴定的DGAT氨基酸系列进行系统进化树分析表明，该基因属于DGAT2，因此将这个基因命名为PiDGAT2-4。其核苷酸序列如SEQ.ID.NO 1所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO 2所示。

本发明通过RT-PCR的方法，在马铃薯致病疫霉中分离到的与三酰甘油合成相关的二酰甘油酰基转移酶基因DGAT2-4；通过酵母突变体互补实验鉴定和转基因酵母突变体细胞内三酰甘油含量测定表明，它是一个新的二酰甘油酰基转移酶基因，其编码的二酰甘油酰基转移酶能够将酰基CoA底物加到Sn-1,2-二酰甘油的Sn-3的位置上形成三酰甘油，可以用于提高植物和微生物中油份含量。

该基因cDNA序列如下：

序列表

(1)SEQ ID NO 1的信息

(a)序列特征

*长度:1146碱基对

*类型:核酸

*链型:双链

*拓扑结构:线性

(b)分子类型:cDNA

(c)假设:否

(d)反义:否

(e)最初来源:马铃薯致病疫霉

(f)序列描述:SEQ IN NO.1

(2)SEQ IN NO.2的信息

(a)序列特征

*长度：381氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

序列描述