[发明专利]一种抗天然牛γ-干扰素的单克隆抗体，分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用

说明书

本发明公开了一种抗天然牛γ‑干扰素的单克隆抗体，分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用。本发明的一株能够稳定分泌抗天然牛γ‑干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为3D7，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9329，保藏日期为2014年6月25日。本发明采用牛γ‑干扰素的真核表达载体免疫小鼠，以间接免疫荧光检测技术，筛选能产生针对天然牛IFN‑γ的抗体的杂交瘤细胞株，成功解决了传统制备IFN‑γ单克隆抗体只能与原核表达产物反应，却与天然IFN‑γ无反应性等问题，为天然牛γ‑干扰素的检测提供了新的技术手段。

技术领域

本发明涉及一种抗牛γ-干扰素的单克隆抗体，分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用，特别涉及一种抗天然牛γ-干扰素的单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株，还涉及该中单克隆抗体在检测天然牛γ-干扰素(IFN-γ)中的应用。本发明属于生物细胞学领域。

背景技术

干扰素(IFN)是在特定的诱生剂作用下由细胞分泌的一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能等生物学活性的糖蛋白，分子量约为20～100kDa，一般由150～170个氨基酸组成，含有17种以上氨基酸，其中天冬氨酸，谷氨酸和亮氨酸含量较高(Iiaacs等，1957)。根据基因序列和受体的不同，可以将IFN分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型3种类型。Ⅰ型主要包括IFN-α、β，还有后来发现的IFN-ε、ψ、κ、δ、τ、ξ等，是由成纤维细胞和上皮细胞被抗原刺激后分泌产生的(Sentsui等，2001)。Ⅱ型干扰素即IFN-γ构成，是由抗原、有丝分裂素等活化免疫细胞，包括CD4+Th1、CD8+T细胞及NK细胞所分泌，因此又称为免疫干扰素。Ⅲ型干扰素是新发现的一类细胞因子，与Ⅰ型干扰素关系密切，称为IFN-λ(Donnelly等，2010)。Ⅰ型干扰素主要表现为抗病毒、抗肿瘤的生物学活性；而Ⅱ型干扰素主要表现为免疫调节的生物学活性(Kenji等，2001)。

IFN-γ基因均含有3个内含子和4个外显子，不同动物的外显子和内含子核苷酸数量不同，但都属于分泌性蛋白，由5’端非编码区、信号肽编码区、多肽编码区和3’端非编码区组成。人、猪和牛IFN-γ前体为166个氨基酸残基，其中前23个氨基酸为信号肽，成熟蛋白大小为143个氨基酸。不同种类动物IFN糖基化位点数目不同，天然牛IFN-γ在第25和97位的天冬酰胺存在2个糖基化位点(Joseph C,1998)。尽管IFN-γ是否糖基化并不影响其在免疫调节方面的生物学活性，但会影响其在动物体内的半衰期(Thiel等，2000)。IFN-γ通常形成二聚体形式，其单体形式没有生物学活性。牛IFN-γ的活性状态一般以二聚体或四聚体的形式存在。

研究表明，内源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态，而特异性抗原刺激引起的IFN-γ反应则可以作为机体针对某种特定外来抗原的免疫指标。目前，IFN-γ体外检测试验不仅服务于基础研究，而且已经被广泛地应用于临床免疫学(Rodriguz MF,1998)、疫苗免疫效果评估(Agger EM,2001)、器官移植(Tary-Lehmann M,1998)、过敏反应(Kubota Y,1999)以及多种病原感染的诊断(Benyoucef S,1997)。其中最重要的应用是牛羊结核病和副结核病的诊断(Walravens K,2002；Kalis CH,2003)。许多学者对外周血T淋巴细胞对结核菌特异性抗原的IFN-γ反应在结核病诊断中的应用进行了研究，结果表明，抗原特异性IFN-γ试验与传统的结核菌素皮试试验(TST)相比有不少优点，由于IFN-γ试验是体外进行，无需观察皮肤增生，结果的判断中包含的主观因素小，且整个检测过程只需要和被检动物接触一次(Lalvani A,2004)。