[发明专利]一种高拷贝pTerm质粒及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种高拷贝pTerm质粒，其特征在于，由colE1复制子基因、原核生物转录终止子、多克隆位点以及抗生素抗性基因组成；在多克隆位点的两端分别设置至少一个所述原核生物转录终止子；所述原核生物转录终止子为不依赖ρ因子的原核生物转录终止子；所述抗生素抗性基因为bla基因或Kan基因中的任一种。

2.根据权利要求1所述的高拷贝pTerm质粒，其特征在于，所述bla基因如SEQ ID No.1所示的序列结构，所述Kan基因如SEQ ID No.4所示的序列结构。

3.根据权利要求1或2所述的高拷贝pTerm质粒，其特征在于，所述质粒的拷贝数为380-560个。

4.根据权利要求3所述的高拷贝pTerm质粒，其特征在于：

所述质粒记为pTerm-HA，如SEQ ID No.7所示的序列结构；所述质粒中，自5’端第22bp～615bp为Terminator基因； 961bp～1821bp为bla基因；1916bp～2598bp为colE1复制子基因；其中多克隆位点在329bp～370bp处；或者，

所述质粒记为pTerm-HK，如SEQ ID No. 8所示的序列结构；所述质粒中，自5’端第132bp～725bp为Terminator基因；1071bp～1886bp为Kan基因；1981bp～2663bp为colE1复制子基因；其中多克隆位点在439bp～480bp处。

5.一种构建权利要求1-4任一所述的高拷贝pTerm质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：人工设计并合成所述的colE1复制子基因、含有原核生物转录终止子基因和多克隆位点的基因片段、抗生素抗性基因片段；所述含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段中在所述多克隆位点的两端分别设置至少一个所述原核生物转录终止子；

步骤二：运用多段重组法将所述colE1复制子基因片段、抗生素抗性基因片段和含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段连接环化，最终得到环形的质粒。

6.根据权利要求5所述的高拷贝pTerm质粒的构建方法，其特征在于，所述的多段重组法为Gibson重组方法，反应体系及条件：按1:1:1的摩尔比取所述colE1基因片段、抗生素抗性基因片段和含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段，加入灭菌去离子水，再加入Gibson Assembly Master Mix试剂， 50℃下反应至得到环形质粒。

7.一种构建权利要求1-4任一所述的高拷贝pTerm系列质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：人工合成所述抗生素抗性bla基因或Kan基因片段；

步骤二：按照权利要求5或6所述方法构建得到含所述抗生素抗性bla基因或Kan基因的pTerm质粒，分别以所述含抗生素抗性bla基因或Kan基因的质粒为模板，F-pTerm-HA/HK、R-pTerm-HA/HK为引物,通过PCR扩增得到colE1-含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段，所述含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段中在所述多克隆位点的两端分别设置至少一个所述原核生物转录终止子；所述引物包括： F-pTerm-HA/HK：5’-ctgtcagaccaagtttactcatatatactt -3’；R-pTerm-HA/HK：5’-TTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATA -3’；步骤三：运用Gibson重组方法，将构建的所述colE1-原核生物转录终止子基因片段分别与所述抗生素抗性Kan基因或bla基因片段进行组装。

8.根据权利要求7所述的高拷贝pTerm质粒的构建方法，其特征在于，所述的Gibson重组方法反应体系及条件：按1:1的摩尔比取所述colE1-含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段分别与所述抗生素抗性bla基因或Kan基因片段，加入灭菌去离子水，再加入Gibson Assembly Master Mix试剂，50℃下反应至得到环形质粒。

9.权利要求1-4任一所述的高拷贝pTerm质粒在基因克隆、筛选和测序领域中的应用。