[发明专利]番茄黄萎病抗性的离体鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种番茄黄萎病抗性的离体鉴定方法，特别涉及一种番茄黄萎病抗性离体鉴定的侵染源、接种数量和方法。

背景技术

番茄黄萎病是保护地和露地番茄生产的重要病害之一。可大幅度降低番茄的产量和品质，是番茄生产的一个主要限制因素。病原（Vertillium dahliae），半知菌亚门、淡色孢科、轮枝菌属。该病具有潜伏侵染和连续发作等特点，一旦发病，无药可治，番茄黄萎病多发生于番茄生长后期，叶片由下向上逐渐变黄，首先是叶缘变色，变色沿叶脉扩大，轮廓清晰，成为“V”形黄斑，以后下部叶片明显枯死。发病重的结果小或不能结果，剖开病株茎部，维管束变浅褐色，病株并不迅速枯死，而是逐渐落叶，表现慢性的向上枯死。因此，鉴定番茄黄萎病抗性种质，培育抗性品种，是防治黄萎病的重要举措。目前黄萎病抗性鉴定多用分生孢子做侵染源侵染活体植株。尤海波等(2003)研究结果表明2片真叶接种黄萎病菌，接种浓度为10 ⁷孢子／ml，采用浸根接种法，浸根20min，温度为20～30℃，15d调查。尤海波(2003)对98份番茄材料进行了抗病性筛选。筛选出了2份免疫材料。3份高抗材料及46份抗病材料和2l份耐病材料，其中抗病材料占大多数。苗期鉴定方法由于受环境因素影响较大，很难快速鉴定出抗病材料。而鉴定栽培品种的抗性资源及抗性基因，通过育种使基因积聚，是今后抗性育种的重要方向。因此，发展一种合适的抗性鉴定方法，鉴定不同品种的抗性，培育抗性品种，是十分必要的。

发明内容

本发明所解决的问题是目前黄萎病抗性鉴定多用分生孢子做侵染源，侵染植株幼苗，一方面由于苗期植物生长比较敏感受环境影响较大，导致鉴定结果可靠性不高；另一方面是分生孢子的数量对发病的速度、发病程度影响较大，难以控制最佳的分生孢子浓度抗性。本发明提供一种番茄黄萎病抗性的离体鉴定方法，用培养的分生孢子使之处于萌发状态，侵染离体的组织，不仅符合黄萎病侵染的规律，而且致病力适中，发病均匀，植物体选择番茄生长期的叶片，环境条件易于控制，可以较好的、快速的鉴定番茄品种对黄萎病的抗性。

本发明的技术方案是：一种番茄黄萎病抗性的离体鉴定方法，它的步骤如下：

（1）从番茄上分离的黄萎病病菌分生孢子做侵染源，培养侵染的黄萎病菌分生孢子，得到侵染的黄萎病菌分生孢子悬浮液；

（2）用侵染的黄萎病菌分生孢子悬浮液接种离体的番茄叶片；

（3）统计叶片发病情况，划分抗性等级。

所述步骤（1）中侵染的黄萎病菌分生孢子悬浮液的方法如下：

① 将黄萎病菌分生孢子接种于PDA培养基上，置恒温光照培养箱中，25℃光照恒温培养30天；

② 将步骤①中成熟的分生孢子取下，在无菌的条件下，置灭菌的研钵中研碎，加入PDA液体培养基；

③ 将步骤②中PDA液体培养基转入45ml离心管中，置离心机中，再1800转/分钟的条件下离心5分钟；

④ 取步骤③离心管中的PDA液体培养基的上清液，转入灭菌的三角烧瓶中，取少量悬浮液，用血球计数板置400倍显微镜计算黄萎病菌分生孢子浓度，然后将悬浮液调节至1×10⁶个/毫升；

⑤ 将步骤④中悬浮液置25℃恒温振荡摇床中，在200转/分钟的条件下培养12小时；

⑥ 将步骤⑤中培养后的悬浮液再2000转/分钟的条件下离心10分钟，去上清，用蒸馏水重悬沉淀，将黄萎病菌分生孢子浓度调节至1×10⁶个/毫升，得到侵染的黄萎病菌分生孢子悬浮液。

所述步骤①中PDA培养基的配方为：去皮马铃薯： 200g，蔗糖20g，琼脂15-20g，蒸馏水1000ml，操作步骤：将去皮马铃薯切成小块，放入烧杯中，加水800ml，煮沸30min，用纱布滤去马铃薯及其残渣；向滤液中分别加入琼脂和蔗糖加热融化，定容至1000ml；将溶液分装到三角烧瓶中，密封，编号；将分装好的溶液放到高压蒸汽灭菌锅中，121℃高压蒸汽灭菌20min；在无菌条件下，将25ml融化的培养基倒入培养皿中，冷却凝固，编号待用。

所述步骤②中PDA液体培养基的配方为：去皮马铃薯： 200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，操作步骤：将去皮马铃薯，切成小块，放入烧杯中，加水800ml，煮沸30min，用纱布滤去马铃薯及其残渣；向滤液中加入葡萄糖，加热融化，定容至1000ml；将溶液分装到三角烧瓶中，密封，编号；将分装好的溶液放到高压蒸汽灭菌锅中，121℃高压蒸汽灭菌20min，待用。