[发明专利]一种快速高通量的登革热病毒检测分型方法

说明书

本发明涉及一种快速高通量的登革热病毒检测分型方法。本发明的检测方法整合了聚合酶链式反应PCR和微阵列这两种强大的分子生物学技术，把PCR杂交的探针直接固定在微阵列中的杂交舱中，与PCR反应室在同一张芯片上；检测方法包括：标本RNA提取，PCR扩增，杂交，清洗，结果判读。本发明能对登革热病毒(血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)进行快速灵敏的检测和分型，通过本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止登革热疫情的发生。

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种快速高通量的登革热病毒检测分型方法。

背景技术

登革热病毒(DV)与黄热病病毒(YEV)、日本脑炎病毒(JEV)和丙型肝炎病毒(HCV)同为黄病毒科(Flav iv iridae)的成员,都可引起严重的人类疾病,引发重大的公共卫生问题。登革热病毒感染主要发生在热带、亚热带地区,可引起登革热(DF)、登革出血热/登革热休克综合症(DHF/DSS)等症状,每年大约有5000万到1亿人受到感染,25000人死亡。20世纪80年代以来流行越来越严重，全球有100多个国家出现流行，最严重是在东南亚及西太平洋地区，全球每年有百多万病例，近25亿人口受到登革热的威胁。

随着全球气候变暖引起的地理分布区的改变、旅游、城镇化、交通的加速发展及病毒载体蚊虫的迁移,登革热病毒将会波及到更多地区。

尤其是2014年6月份，广州爆发的感染登革热病例的疫情，随后疫情在各地发展。截至2014年10月21日零时，2014年广东全省共有20个地级市累计报告登革热病例38753例，其中重症病例20例，死亡病例6例。登革热流行不仅造成巨大的经济损失和社会损失，而且引起不必要的恐慌，严重影响外来投资环境。

由于登革热病毒的复制、感染及致病机理尚未阐明,以及针对4种血清型的4价疫苗开发的困境,迄今为止还没有有效的疫苗可用于临床。对确定有DHF/DSS症状的病人,及时有效的医疗护理成为减轻症状,避免死亡的唯一有效措施。因此,临床上快速准确地诊断登革热病毒感染至关重要。

到目前为止，登革热病毒的检测最原始、经典的方法是特异性病毒分离培养，但由于操作繁琐、技术难度大且耗时长、实验条件要求高、存在严重的生物安全问题，在实际工作中难以推广应用。其实是通过核酸检测和抗体阳性检测。核酸检测需要两个小时才出结果，而抗体阳性检测一个小时则可以出结果，但是抗体阳性检测发病后五天内的检出率为50％，可能会漏诊登革热病例，也不利于疫情控制。准确率比较高的检测方法是核酸检测，但是常规的PCR操作复杂，设备庞大，技术难度比较高，不利于口岸现场诊断以及疫区现场检测。因此迫切需要研发一种新型的快速、简单的核酸检测方法。本发明专利通过研究一种基因芯片来检测和分型四种血清型的登革热病毒。

基因芯片技术利用待检测样品的基因组序列设计针对各种微生物的特异探针，将该探针(寡核苷酸)点样于芯片表面，同时在探针两侧设计PCR引物，在引物合成过程中对其5’端进行荧光标记或在PCR过程中加入荧光标记的dNTP，这样利用PCR扩增的方法即可得到标记有荧光染料的待检测靶标，然后用含有待检测样品特异探针的微阵列芯片与标记的靶标杂交，荧光标记的DNA分子与芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯片上的点呈现出荧光信号，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定登革热病毒。

当前用于登革热病毒检测的基因芯片检测已经有些应用于研究，但是这些基因芯片的探针点样多采用手工模式，操作复杂，并且增加了很多假阳性的机会。

本发明整合了聚合酶链式反应(PCR)和微阵列这两种强大的分子生物学技术，把PCR杂交的探针直接固定在微阵列中的杂交舱中，与PCR反应室在同一张芯片上。同时本发明把四种常见血清型的登革热病毒的检测在一张芯片上完成，实现了登革热检测的高通量。PCR反应结束后可以直接加入杂交液进行杂交，操作简单，节省时间。