[发明专利]苏云金芽胞杆菌分泌杀虫基因sip1A，表达蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，特别是进一步，本发明涉及对鞘翅目农业害虫具有高毒力的Bt分泌杀虫基因及由该基因所编码的蛋白质。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽胞形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E,Crickmore.N,Van Rie.J.,Lereclus.D,Baum.J,Feitelson.J,Zeigler.D.R.,Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev,1998,62(3):775-806.]。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一个ICPs基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，目前(2014年4月)共776个，其中cry基因738个，cry模式基因289个；cyt基因38个，cyt模式基因11个。当今，采用喷施化学农药防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害,但化学农药造成环境污染,长期以来,大量喷施化学杀虫剂,不仅会增强害虫的抗药性,使益虫及其它生态区系遭受破坏,而且严重污染环境,提高生产成本,破坏生态平衡。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。苏云金芽胞杆菌除了直接作为生物农药以外，1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Bt cry1Ac。在接下来的几年里，转cry1Ab基因的抗虫玉米，转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有cry1Ac/cry1Ab基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2013年，27个国家的1800万农民种植了1.752亿公顷(4.33亿英亩)的转基因作物，比2012年持续增长了3％，即500万公顷(1200万英亩)。1800万农民从转基因作物中获益，其中90％为资源匮乏的小农户。前五个种植转基因作物的发展中国家是亚洲的中国和印度、拉丁美洲的巴西和阿根廷以及非洲的南非，共种植8270万公顷的转基因作物，占全球转基因作物种植面积的47％，并且这五个国家的人口约占全球70亿人口的41％。中国750万资源匮乏的小农户种植了420万公顷的Bt棉花，采用率为90％，平均每户农民种植0.5公顷的Bt棉花。转基因作物商业化给工业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效益。苏云金芽胞杆菌及其基因发掘已成为可持续发展农业中重要课题。

由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。

发明内容

本发明提供一种对鞘翅目害虫大猿叶甲高毒力的苏云金芽胞杆菌QZL38，及其杀虫新基因分泌基因sip1A和其晶体杀虫蛋白，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。

苏云金芽胞杆菌菌株QZL38，其保藏编号为：CGMCC No.9641。

苏云金芽胞杆菌菌株QZL38在杀灭鞘翅目农业害虫中的应用。

杀虫分泌蛋白Sip1A，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

sip1A基因，编码杀虫蛋白Sip1A。

优选其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

一种表达载体，其特征是含有sip1A基因。

所述表达载体为pEB-sip1A，其骨架载体为pEB，其结构如图6所示；或者所述表达载体为pET21b-cry1Ca，其骨架载体为pET21b，其结构如图7所示。