[发明专利]异尖线虫的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物检测技术领域，具体涉及一种异尖线虫的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

随着鲜食生鱼的饮食时尚的兴起,异尖线虫病已成为重要的食源性人兽共患寄生虫病。为了解海产品异尖线虫感染状况，有必要对市面上流通的海产品进行异尖线虫的检测。但传统的检测方法主要通过形态学鉴定技术，操作繁琐，比较耗时，检出率低。

相比传统检测方法的缺点，现有采用的生物分子检测方法，多通过对待侧样本的前处理、核酸提取、凝胶电泳等步骤进行，但该方法实施过程中凝胶电泳的操作,容易出现假阳性结果，同时过程也比较繁琐。

发明内容

本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种光学系统检测荧光信号减少了假阳性、缩短了检测时间的异尖线虫的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种异尖线虫的实时荧光PCR检测试剂盒，包括PCR特异性引物和荧光探针；其中，

所述PCR特异性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的异尖线虫核糖体18s上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的异尖线虫核糖体18s下游引物；

所述荧光探针具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列，且所述荧光探针5’端标记荧光报告基团、3’端标记荧光淬灭基团。

本发明的试剂盒，使用时对从待测标样提取的DNA进行PCR扩增，检测扩增过程中的荧光变化，即可实现异尖线虫的检测；检测过程是实时反映靶基因扩增的过程，并根据内参或外参直接反映出靶基因的拷贝数；相比现有的方法，具有灵敏度高、特异性强、周期短、高通量等优点，同时通过光学系统检测荧光信号而省去了凝胶电泳的繁琐操作，既减少了假阳性的发生率和对人、环境的潜在危害，同时缩短了检测时间。

本发明进一步还提出一种异尖线虫的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：

提取待测样本DNA；

以提取的待测样本DNA为模板进行实时荧光PCR；其中所述实时荧光PCR过程中采用的引物为具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的异尖线虫核糖体18s上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的异尖线虫核糖体18s下游引物；所述实时荧光PCR过程中采用的荧光探针为具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的荧光探针，且所述荧光探针5’端标记荧光报告基团、3’端标记荧光淬灭基团；

检测PCR过程中的荧光信号。

本发明的检测方法，通过特异性设计的灵敏性引物和探针，对从待测标样提取的DNA进行PCR扩增，检测扩增过程中的荧光变化，即可实现异尖线虫的检测；检测精度高、结果准确，且过程快速简便。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明以华支睾吸虫、广州管圆线虫、弓形体、日本血吸虫、异尖线虫、卫氏并殖吸虫为待测标样进行检测的荧光变化图；

图2为本发明的以华支睾吸虫、广州管圆线虫、弓形体、日本血吸虫、异尖线虫、卫氏并殖吸虫为待测标样扩增产物的电泳结果图；

图3为灵敏性实验分析验证本发明方法的灵敏性过程中的荧光变化图；

图4为灵敏性实验分析验证本发明方法的灵敏性结果的线性曲线；

图5为灵敏性实验分析验证本发明方法的灵敏性结果的数据表。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种异尖线虫的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：

S10，获取待测样本，并提取待测样本DNA；

S20，以提取的待测样本DNA为模板进行实时荧光PCR；

S30，检测PCR过程中的荧光信号。

本发明上述过程通过对待测的DNA样本进行扩增，并通过扩增过程中荧光探针产生的荧光信号变化，从而便可以得知待测样本是否含有目标病原体；其中，在步骤S20的实时荧光PCR中采用的特异性引物和荧光探针如下：