[发明专利]基于液相芯片定量检测Alu基因甲基化水平的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基因甲基化水平的定量检测方法。

背景技术

Alu和LINE等重复序列是研究基因组整体甲基化水平的主要靶基因。

Alu家族是灵长类动物基因组内最具特征性的短散在重复序列。人Alu元件由两个不完全对称的单体组成，典型Alu长282 bp，左右两部分为同源序列，其间为富含腺苷酸的连接区。Alu RNA实质上为获得polyA结构的7sL RNA二聚体，而7sL RNA是信号识别颗粒的重要组成部分。Alu序列作为人类基因组中的调控序列，对基因表达的调节起重要作用。Alu元件的去甲基化是基因组稳定性降低的标志，也是基因组重组和染色体易位的必要条件。

目前，甲基化水平的检测方法主要有甲基化特异PCR (MSP)、结合亚硫酸盐的限制性内切酶分析 (COBRA)、亚硫酸氢盐基因测序(BSP)、焦磷酸测序、定量甲基化特异PCR (Methylight) 以及高分辨率溶解曲线检测 (HRM)等。目前运用这些方法对Alu序列进行甲基化水平检测存在以下这些问题：MSP和COBRA方法均局限于对某一或两个位点进行定性检测，对操作过程和位点选择有很高的要求，受标本个体差异的影响较大，同时定性检测不如定量检测准确可靠；BSP 和焦磷酸测序虽然可以检测一定范围内DNA序列的所有CpG位点的甲基化水平，但操作繁琐，每一个样本检测均需构建多个克隆，分别测序后统计分析甲基化水平，甲基化水平结果的准确性在一定程度上取决于选取克隆数的多少，并且这两种方法并不能称为是完全意义上的定量检测；Methylight虽然可以定量检测基因的甲基化水平，但目前一般只对基因中某一个位点进行检测，Alu序列中有多个CpG位点，其中的某一个位点的甲基化水平是否能够完全代表Alu基因的整体甲基化水平还有待研究。HRM检测可以检测基因整体的甲基化水平，对基因中的各个CpG位点的具体甲基化水平却无法研究。

因此，针对Alu基因，建立一种新的、操作简便、准确可靠的定量甲基化检测方法十分有必要。

发明内容

本发明的目的在于针对Alu基因，提供一种操作简便、准确可靠的基于液相芯片定量检测Alu基因甲基化水平的方法。

本发明的技术解决方案是

一种基于液相芯片定量检测Alu基因甲基化水平的方法，其特征是：包括下列步骤：（1）针对亚硫酸氢钠转化后的Alu序列设计相应引物；（2）标本血清DNA提取和亚硫酸氢钠处理；（3）对处理后的标本进行BSP测序；（4）根据测序结果，分析筛选出检测位点，并针对该位点设计相应探针；（5）制备标准品和样品PCR产物；（6）将探针包被到微球上（7）将包被了探针的微球与PCR产物杂交孵育，并在液相芯片机器上进行检测，读取数据；（8）根据标准品绘制标准曲线后，计算出每个样品的甲基化水平。

步骤（1）中，选择Alu 22bp～259bp为靶序列，此片段中共有17个CpG位点，针对这个片段，上下游引物分别为5'- TTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGT -3'和5'- CCCAAACTAAAATACAATAA -3'。

步骤（5）中，基因合成24个CpG位点分别为CG和TG两种碱基类型的两段Alu基因，以这两段序列的系列体积比稀释溶液作为该方法的系列标准品溶液。

通过BSP检测标本后选择185bp进行下游检测，根据此位点设计的探针序列为：探针CG：NH2-TTTTTTTTTTGAATTCGGGAGGCGGAGGT，和探针TG：NH2-TTTTTTTTTTGAATTTGGGAGGTGGAGGT。

Alu序列是根据RepeatMasker和相关文献报道找到的Alu家族的共有保守序列（图1）。经亚硫酸氢钠处理后，Alu原序列中的CpG位点处的C不变，其他位置的C变为T，以该转化后的序列——亚硫酸氢钠转化后的Alu序列作为下游检测的模板（图2）。发生了甲基化的CpG位点，经过亚硫酸氢钠处理后仍然为CG，而处于非甲基化状态的CpG位点，经过处理后变为TG，由于我们需要得到所有甲基化和非甲基化产物，故设计引物时避开CpG位点，选择Alu 22bp～259bp为靶序列，此片段中共有17个CpG位点，针对这个片段，本发明中Alu基因的上下游引物分别为5'- TTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGT -3'和5'- CCCAAACTAAAATACAATAA -3'（图2 方框处），以此序列作为BSP检测的上下游引物；在该上下游引物5’端加上生物素标记，作为基于液相芯片的定量甲基化检测的引物。