[发明专利]一种大肠菌群的快速检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物分子检测技术应用领域，具体涉及一种灵敏度高，特异性强的可视化大肠菌群环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒及其应用。

背景技术

大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：一群在36℃条件下培养24h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌除包括大肠杆菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸椽酸菌属、克雷伯菌属。

大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染，推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性。快速检验大肠菌群，有助于食品的卫生管理，维护消费者的健康安全。现有的检测方法主要是传统的细菌培养计数及其改进方法，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法。

环介导等温扩增 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法（国际专利公开号WO 00/28082），针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，在1h内能达到10⁹靶序列拷贝，通过荧光染料显色，在自然光下肉眼观察判断结果，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。

发明内容

本发明的一个目的是在于提供一种可视化大肠菌群环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒。根据肠杆菌科的16s rDNA基因保守区序列设计环介导等温扩增引物，应用PrimerExplorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）在线软件设计特异性引物组，利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平上实现大肠菌群的快速检测，为大肠菌群检测提供了有效且快速的核酸筛查检测方法，可替代传统的大肠菌群的检测方法，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

本发明的另一个目的是在于提供一种可视化大肠菌群环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒的应用，仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内，通过对样品简单的处理便可快速检测样品中的大肠菌群是否合格。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种可视化大肠菌群环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒

该试剂盒由反应预混液、荧光显色剂、内盖附有灭菌滤纸片的检测管组成，其中的反应预混液包括Bst DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、特异性引物组、甜菜碱和无菌双蒸水。

所述特异性引物组包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1-4所示。

一种可视化大肠菌群环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒的应用

使用方法包括待检样品中细菌DNA的提取、环介导等温扩增和显色结果判定：

1、待检样品中细菌DNA的提取：

采用DNA快速提取法，即将样品稀释液煮沸，上清液作为环介导等温扩增反应的DNA模板。

2、LAMP扩增：

采用25μl反应体系：内引物FIP和BIP各1.6μM，外引物F3和B3各0.2μM，dNTP 1mM，甜菜碱0.5M，硫酸镁6mM，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA 5μl，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μl，选择64℃避光反应60分钟。

3、检测结果判定：

将检测管倒置甩动，使反应液与内盖上的滤纸片充分混匀，室温放置2分钟；正置后用力甩动检测管，使管内混有荧光显色剂的反应液聚于检测管底部，在比色卡背景下观察反应液颜色：黄绿色则说明样品中的大肠菌群不合格，棕色则说明样品中的大肠菌群合格。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、特异性好，能有效检测样本中是否存在大肠菌群特定基因片段，进而确定样本中是否存在大肠菌群；

2、快速高效，能在不到2小时完成检测；

3、不需要使用昂贵、精密的仪器设备，只需普通的金属浴或水浴锅，检测成本低；

4、鉴定方便简单，自然光下通过肉眼目测反应液颜色变化即可进行结果判断；

5、整个过程不涉及有毒试剂，保证了操作人员及环境的安全。