[发明专利]一种用精胺诱导甘蔗胚状体的方法

说明书

技术领域

本发明属植物生物技术的组织培养技术领域，尤其是一种用精胺诱导甘蔗胚状体的方法。

技术背景

“胚状体”是由愈伤组织中的部分薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接再分化形成具有胚的功能的结构，也叫做“体细胞胚”或“体胚”，以区别于“合子胚”。“胚状体”在生产上可以直接用于制造人工种子和生产再生植株(试管苗)；在理论研究上，是探索细胞分化、器官建成、个体发育，及其相关的解剖学和生理生化变化过程的重要材料。因此，如何获得胚状体是植物学界关心的热门技术领域之一。对于甘蔗胚状体的研究已有一些报导，但是诱导剂都是使用2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)，在获得愈伤组织之后，再转移到较低浓度2,4-D、甚至不含2,4-D的培养基中，以减少2,4-D对培养材料的毒害导致胚状体诱导的失败。即使如此，诱导率也仅有10％左右【甘蔗体细胞培养中的胚状体发生[J].植物生理学报曾吉恕1979，5(4)：411-416】；【甘蔗幼叶切段培养中的体细胞胚胎发生[J]广西植物李春瑶等，1989,9(3)：243-246】。还有人再复配6-BA(N⁶-苄基腺嘌呤)、NAA(萘乙酸)或乳蛋白，把诱导率提高到30％-50％【激素对甘蔗心叶胚状体发生的影响[J]吉林师范大学学报(自然科学版)孙颖2004,8(3)：93-94】。李松和许鸿源等曾用LFS(灵发素,代号PGR-08)把甘蔗胚状体的诱导率提高到90％以上【一种用灵发素诱导甘蔗胚状体的方法中国专利ZL201010216154.6】。遗憾的是，灵发素在国内没有厂家生产，进口价格十分昂贵，导致应用受到极大限制。精胺(Spermine,，Spm.)是多胺的一种,普遍存在于高等植物界，是纯天然的植物生长调节物质【多胺是植物生长发育的调节物[J]植物生理学通讯，潘瑞炽1985(6)：63-68】，而且价格低廉，易于在科学研究和规模化生产中推广应用。人们对其促进植物生长、延缓衰老、增强抗逆能力，等生理活性的研究，已经有不少报导。但是，还未能检索到精胺用于诱导甘蔗胚状体的研究资料。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用精胺诱导甘蔗胚状体的方法。

本发明以如下技术方案解决上述技术问题：

一种用精胺诱导甘蔗胚状体的方法，包括如下步骤：

以常规方法获得的甘蔗幼叶切片作外植体，常规消毒后，接种到MS+精胺(Spm.)2.5mg·L^-1(该浓度为优选后的适宜浓度)，pH 5.8-6.0的固体培养基，在常规培养条件下培养20d诱导并获得甘蔗愈伤组织团块。

将上述愈伤组织团块在不做任何变动的情况下，再继续培养15d和20d，总计培养时间分别达到35d和40d。陆续有形态各异的胚状体发生。

或者将上述已经培养20d并诱导出愈伤组织的团块小心转移到新鲜的原培养基，尽量避免伤损培养物，每瓶4-5团培养物，每批试验不少于6瓶。在常规培养条件下再培养10d和15d，总计培养时间分别达到30d和35d。即有大量胚状体发生。胚状体的发生速度更快，总数更多。

本发明的突出优点是：

本发明用于甘蔗胚状体的诱导，速度快，效率高，品质好。所得胚状体容易继续再分化出根、叶器官和完整再生植株，总体效果既优于用2,4-D诱导甘蔗胚状体的传统技术，也优于用LFS诱导甘蔗胚状体的新技术，生产成本更低。

具体实施方式

以下通过实施案例对本发明的技术方案作进一步说明。

本发明所述用精胺诱导甘蔗胚状体的方法包括以下步骤：

依常规方法剥取甘蔗末梢靠内部的蛋黄色幼叶，分切成大约0.5cm×0.5cm的切片，接种到含有Spm.2.5mg·L^-11(该浓度为优选后的适宜浓度)的改良型MS固体培养基中，每批试验不少于10瓶，每瓶4-5片。在常规培养条件下培养20d诱导并获得甘蔗愈伤组织团块。在不做任何变动的情况下，继续培养15d和20d，总计培养时间分别达到35d和40d。陆续有形态各异的胚状体发生。

或者将上述已经培养20d并诱导出愈伤组织的团块小心转移到新鲜的原培养基，尽量避免伤损培养物，每瓶4-5团培养物，每批试验不少于6瓶。在常规培养条件下再培养10d和15d，总计培养时间分别达到30d和35d，即有大量胚状体发生，胚状体的发生速度更快，效率更高，成本更低。