[发明专利]榉树SSR1标记、引物对及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物科学中的分子标记技术领域，尤其涉及一种榉树SSR1标记、引物对及其制备方法和应用。

背景技术

榉树(Zelkova schneideriana Hand.-Mazz.)为榆科(Ulmaceae)榉树属(Zelkova)落叶大乔木，为我国特有种。榉树分布于我国淮河流域、秦岭以南的长江中下游地区。榉树木材致密坚硬，材色鲜艳，纹理美观，耐腐性强，是生产各类高档家具和工艺品的上等木材。同时，由于其树形优美，树冠冠幅大，叶色季相变化丰富，也是深受人们喜爱的传统色叶园林风景树种。因榉树种子萌发率低，自然更新困难，而且频遭人类砍伐，故其野生资源日渐稀少，已被列为国家二级重点保护植物。

SSR标记(Simple sequence repeat)，也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸为重复单位组成的长达几十乃至数百个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此产生SSR标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。SSR标记具有以下优点：(1)标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上；(2)是共显性标记，呈孟德尔遗传；(3)技术重复性好，易于操作，结果可靠。

尽管国内外的学者已经使用ISSR、RAPD等多种标记研究了榉树群体的遗传多样性，但是ISSR和RAPD两种标记均为显性标记，稳定性差，且不能直接应用于分子标记辅助育种和QTL定位。因此，研究榉树SSR标记、开发榉树的SSR引物很有必要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种榉树SSR1标记、引物对及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：榉树SSR标记，具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列，微卫星标记编号为SSR1。

扩增上述榉树SSR标记的引物对JS1，包括具有序列表SEQ.ID.No.2和SEQ.ID.No.3的碱基序列。

上述榉树SSR标记的制备方法，利用特定引物对JS1对榉树总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列；引物对JS1包括具有序列表SEQ.ID.No.2和SEQ.ID.No.3的碱基序列。

上述榉树SSR标记的制备方法，包括以下步骤：

<1>榉树总DNA提取与酶切

选取榉树幼嫩的叶片，用CTAB法提取核基因组；用EcoRV在37℃下酶切3h，65℃下20min灭活内切酶；反应体系20μL，包括2.0μL的10×Buffer，1.0μL的EcoRV内切酶，2μL的DNA，15.0μL的灭菌双蒸水；

<2>接头的连接

将步骤<1>EcoRV酶切的榉树基因组DNA连接上下接头；60μL连接体系中含有酶切的榉树基因组DNA 9μL，上下接头各100pmol；连接反应在1倍T4连接酶缓冲条件下进行，于16℃连接过夜；连接后的混合物在65℃反应20min，灭活连接酶；

<3>连接产物的扩增

过夜步骤<2>连接后的混合物以AP2和复合SSR引物为上下引物对连接后的混合物进行PCR扩增；1.5％的琼脂胶电泳，切胶回收500-1000bp的片段，试剂盒纯化；

<4>克隆并筛选富集的微卫星DNA片段

将步骤<3>PCR产物连接到载体pMD18-T Vectors上，然后转化到感受态JM109细胞中，涂布到含有Amp的平板培养基上，37℃培养过夜；用M13引物进行PCR扩增检测，选取400-1000bp左右的片段；

<5>测序、引物设计与扩增分析

将步骤<4>PCR产物送测序；利用Primer5.0软件对测序结果进行SSR引物设计并送合成，得引物对JS1；利用引物对JS1在榉树基因组中扩增出片段SSR1标记。