[发明专利]一种快速检测水稻黑条矮缩病病原的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物保护技术领域，尤其是一种快速检测水稻黑条矮缩病病原的方法。

背景技术

水稻是一种重要的粮食作物，但其安全生产常受到病害的侵扰。水稻黑条矮缩病是其中危害最为严重的病毒病之一，主要分布日本、朝鲜、越南、中国等水稻种植区。迄今为止，已发现该病害可由两种病毒单独或复合侵染所致(Zhang et al.,2013；Wu et al.,2013)。一是水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)，是呼肠孤病毒科斐济病毒属确定成员，主要传播媒介是灰飞虱；另一种是近年新发现的水稻新病毒——南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)，又名水稻黑条矮缩病毒2号(Rice black-streaked dwarf virus 2，RBSDV-2)，是呼肠孤病毒科斐济病毒属暂定成员，主要通过白背飞虱传播。二者症状相似性、分布上的重叠性、田间侵染的复杂性使得检测与诊断更加困难，而病株和带毒昆虫的快速准确检测诊断又是病害准确预测和有效监控的前提。

血清学方法因其简单快速、成本低廉，比较适合于大规模田间样品的检测。一般而言，一次ELISA分析，仅能用一种血清来能识别一种或几种血清学相关的病毒，但难以同步区分血清学相关但种类不同的病毒；专一性仅识别RBSDV或仅识别SRBSDV的单克隆抗体尚未有研制成功的报道。因此，目前尚缺乏应用血清学方法同步区分RBSDV、SRBSDV的报道。近年来，随着多个RBSDV、SRBSDV分离物基因组序列的完成(Zhang et al.,2001；Wang et al.,2003；Zhang et al.,2008；Zhou et al.,2008；Wang et al.,2010；Xue et al.,2014)，分子生物学检测RBSDV、SRBSDV的技术得到迅速发展。巢式和一步RT-PCR、多重RT-PCR(mRT-PCR)、双重实时定量RT-PCR(qRT-PCR)(周倩等，2010；季英华等，2011；王强等，2012；Wu et al.,2013；Zhang et al.，2013)等分子方法被相继用来检测和区分RBSDV、SRBSDV。但这些方法常需要多对引物或探针、或扩增后电泳、染色等过程。本发明针对上述生产实际，发展建立了一种仅应用1对引物且无需其他任何探针和扩增后电泳、EB染色、紫外灯下观察等步骤，就可高通量、快速同步检测区分RBSDV、SRBSDV的方法，为水稻黑条矮缩病的准确诊断、预测预报和科学防控提供了技术支撑。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种高通量同步检测区分RBSDV、SRBSDV的快速检测水稻黑条矮缩病病原的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种快速灵敏的检测水稻黑条矮缩病病原的方法，仅应用一对引物，以样品总RNA为模板进行RT-PCR扩增。该引物序列为：

HRM2-1，5’-ACT TCT CTA ATC CYT TAT AC-3’

HRM2-2，5’-GTA TCA ATC ATT CTT TMC AT-3’

最后根据扩增产物的高分辨率熔解判断水稻黑条矮缩病样品中RBSDV、SRBSDV的侵染状况，具体包括以下步骤：

引物设计：通过比对分析GenBank数据库公布和本实验室测定的RBSDV、SRBSDV全基因组序列，获得2种病毒种间保守和多态性相间的区域，按照引物条件选取特定区域设计了2种水稻病毒的1对特异性引物。

样品总RNA提取：对于水稻等植物样品，取适量病株或健株叶片于研钵中加液氮研磨成粉状，转入1.5mL离心管后，再加入1mL TRIzol试剂(Invitrogen)；对于飞虱样品，取单头虫体，置于1.5mL离心管中，加入500μLTRIzol试剂(Invitrogen)，再用经过高温处理的玻棒将虫体充分研磨；此后的操作均按TRIzol试剂使用说明书提取总RNA，提取的总RNA保存于-80℃冰箱中备用。