[发明专利]从玉米中分离的双向启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及从植物中分离的启动子，尤其涉及从玉米(Zea mays)中分离的双向启动子及其应用，属于双向启动子的分离和应用领域。

背景技术

通过导入外源基因使植物获得新的性状并能稳定遗传是植物基因工程的最终目的。花椰菜病毒CaMV 35S启动子以及玉米UBI启动子作为稳定、高效的外源启动子，一直被人们广泛的使用。然而在转基因过程中，由于重复序列的出现会引起基因沉默现象，尤其是进行多个基因导入时，基因沉默现象会更严重，以至严重影响了转基因植株的获得和后代的稳定性。在进行两个或两个以上基因导入时，通常需要这些基因的表达量、表达时间和位置的同一性，进而确保转入基因行使正常的功能，但使用35S启动子或者玉米UBI启动子很难达到这样的要求，这些都是植物基因工程中亟待解决的技术问题。

对于转基因引起的基因沉默现象人们已经有了比较深入的认识，引起转基因沉默有多种因素，其中最主要的就是重复序列的产生，尤其是多个基因导入时，更人为的造成了多个35S启动子插入的情况，对此至今尚无有效的解决方法。随着基因组学的发展，多种生物基因组测序已完成，经过生物信息学分析人们发现了双向启动子的存在，这为利用植物自身的双向启动子进行转基因操作从而避免多基因插入引起的基因沉默现象提供了可能。通过表达载体将最大数量的基因整合到植物基因组中，需要限制用于表达转基因核酸的调控序列的数量和大小，双向启动子为实现该目标功不可没。双向表达系统允许以化学计量学的方式控制转基因的表达，此外，由于双向表达的缘故，一个表达控制序列能控制两个目的基因的表达，能够有效降低导入生物体重进行异源基因表达的表达盒数量并能有效避免多基因插入引起的基因沉默现象。

玉米(Zea mays)是中国最大的粮食作物，也是重要的转基因作物。从玉米中分离获得双向启动子，可以利用双向启动子将两个目的基因在植物中进行双向表达并有效避免多基因表达所存在的基因沉默现象。

发明内容

本发明目的之一是提供从玉米(Zea mays)中分离的双向启动子。

本发明目的之二是提供含有上述双向启动子的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞。

本发明目的之三是将所述的双向启动子以及含有该双向启动子的重组表达载体应用于构建转基因植物、改良农作物性状以及培育具有优良性状的植物新品种等方面。

为实现上述目的，本发明首先提供了从玉米(Zea mays)中分离的双向启动子，其多核苷酸序列为(a)或(b)或(c)所示:

(a)、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的多核苷酸序列；或

(b)、分别与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有双向启动子的功能；或

(c)、分别与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的多核苷酸序列至少有60％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有双向启动子的功能；优选的，分别与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有双向启动子的功能；更优选的，分别与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有双向启动子的功能。

本发明将SEQ ID NO.1所示的ZmBD1全长启动子从5’端开始逐渐删除部分序列得到六个截短的启动子缺失片段，这六个启动子缺失片段的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；本发明在这6个启动子缺失片段的两端各融合一个报告基因GUS/GFP，构建得到稳定表达的双向表达载体；转化实验证明，这6个启动子缺失片段均能同时驱动两个报告基因在玉米幼胚中进行稳定表达，说明这6个启动子缺失片段仍具有双向启动子的功能。