[发明专利]利用斑马鱼胚胎测试天然植物提取物急性毒性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及毒性检测领域，具体涉及一种利用斑马鱼胚胎测试植物提取物急性毒性的方法。

背景技术

自20世纪70年代美国Oregon大学著名遗传学家George Streisinger详细报道了斑马鱼的体外受精技术、单倍体诱导等技术，并建立其纯合品系，使得斑马鱼初步具备了成为模式动物的条件，为其迅速发展奠定了坚实的基础。进入21世纪，同果蝇、小鼠、兔子等经典模式动物相比，斑马鱼凭借其明显优势：(1)个体小；(2)发育快速，性成熟期短，繁殖能力强；(3)卵和胚胎透明，体外受精，体外发育，易于观察和操作；(4)胚胎小，每次测定只需少量样品，(5)下药方式简单，水溶性化合物可溶于培养水中扩散至胚胎，脂溶性化合物可通过显微注射到胚胎中；(6)胚胎学和遗传学操作技术成熟，且品系资源十分丰富；(7)温度适合时，一年四季均可人为控制产卵，且后代数量大；(8)全基因组序列测定已完成，与人类基因的相似度达87％，意味着在斑马鱼上做的毒性试验所得的结果在多数情况下也适用于人体；(9)目前已获得大量的斑马鱼突变体，迄今已鉴定有8000多种斑马鱼突变体，其中1/4成为人类疾病模型，比如人类贫血、耳聋、肌无力症、恶性肿瘤和阿尔茨海默病等，以上优势使斑马鱼成为国际标准化组织认可的五种试验标准鱼类之一。在2011年举行的世界合同定制服务中国展(ICSE China)认为斑马鱼相对于传统的模式生物，在高内涵、全自动、高通量筛选方面所凸显出来的巨大优势特别适用于人工合成化合物、天然植物药、动物药和海洋药物等的筛选，包括天然产品在营养保健、护肤美容中的应用。目前，斑马鱼是可进行高通量药物毒性筛选和安全性评价的唯一脊椎动物模型。因此，作为新兴的实验动物资源，斑马鱼在生命科学研究和生物医药领域中的应用呈快速增长趋势。

本发明旨在建议一种利用斑马鱼胚胎测试植物提取物急性毒性的方法，以模式动物斑马鱼为实验动物，从繁养和利用斑马鱼胚胎对天然植物提取物进行急性毒性试验并对该其进行安全性评估，建立早期、灵敏及高通量筛选的急性毒性检测平台，为进一步研发提供基础数据和实验依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用斑马鱼胚胎测试天然植物提取物急性毒性的方法。

本发明采用的技术方案为：

一种利用斑马鱼胚胎测试天然植物提取物急性毒性的方法，包括如下步骤：

配制胚胎培养液，即胚胎的培养用水，其中胚胎培养液含有：NaCl 5mM，KCl 0.17mM，C aCl₂0.33mM，MgSO₄0.33mM，以1M NaOH调节pH至6.8-7.0，电导率在500-550μs；

将植物提取物粉末以二甲基亚砜溶解至澄清，过滤2次，用胚胎培养液稀释，获得含植物提取物不同浓度的稀释液，不同浓度的稀释液中所含二甲基亚砜最终浓度一致且最终浓度小于等于1.2％(V/V)；用不同浓度的稀释液培养斑马鱼胚胎，然后在7-72 hpf观察记录不同浓度的稀释液对斑马鱼胚胎发育的影响，来判断植物提取物对斑马鱼胚胎发育的毒性。

优选地，所述的斑马鱼胚胎为处于4hpf(囊胚期)的胚胎。因为囊胚期为细胞高度分裂期，对毒性作用敏感。进一步，所述的斑马鱼为AB系斑马鱼。

优选地，所述斑马鱼胚胎通过如下方法选择：

选择游动和体色均正常3月龄的斑马鱼，繁养条件：通过光控系统，保持光照14h/黑暗10h交替的光照周期；水温维持在28.5℃；繁养用水电导率控制在500-550μs，由NaCl饱和溶液调节；同时pH控制在7.2-7.5，由NaHCO₃溶液调节；投喂由美国大盐湖丰年虫卵，孵化24h的丰年虾，2-3次/天；选择游动和体色均正常，摄食无异常的4月以上性成熟的健康成鱼(更优选为5月龄)进行配对，产卵前天傍晚亲鱼经投喂后，按照雌雄比例1:2或1：1，放入交配盒，以透明挡板分开，第二天早上经光刺激后于9点-10点取出挡板，自然交配并收集受精卵，用胚胎培养液清洗1-2次去除坏卵、粪便和杂质后，置于胚胎培养液中，在28.5℃，无光照的恒温培养箱中进行静置培养，每毫升培养液中最多只培养10个胚胎；当4hpf时，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达80％以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎。