[发明专利]反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，包括引物、探针和FRET-PCR标准品，其特征在于：所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针；

所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；

所述6-FAM探针具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；

所述LCRed640探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；

所述下游引物具有SEQ ID No.4的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：引物、6-FAM探针、LCRed640探针、PCR缓冲液、热启动Taq酶、dNTP、FRET-PCR标准品、PCR阴性对照；所述PCR阴性对照为双蒸水。

3.根据权利要求2所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征在于:所述FRET-PCR标准品是由所述的FRET-PCR的引物和探针对DNA质粒标准品模板进行扩增获得的扩增核苷酸片段插入pUC57载体构建而成的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征在于：所述DNA质粒标准品模板的浓度为100gene copies/μl。

5.一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系,其特征在于：实时荧光定量FRET-PCR扩增对象包括DNA质粒标准品模板、PCR阴性对照；

实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系包括20μl的扩增体系：10μl的样品DNA模板或者定量DNA标准试剂、1xPCR缓冲液、1μM上游引物、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μM dNTP。

6.一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的反转录PCR扩增检测体系,其特征在于：反转录PCR扩增对象包括RNA标准品模板、RNA提取的阴性对照和RT-PCR阴性对照；

反转录PCR扩增检测体系包括20μl的扩增体系包含：10μl的样品RNA模板或者定量RNA标准试剂、1xPCR缓冲液、1μM上游引物、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μM dNTP、0.14个单位的商业化反转录酶、20个单位的商业化RNA酶抑制剂。

7.一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增设置反应条件包括：预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环；预变性：1x 2min@95℃；18个温度递减的高严谨循环：6x 1sec@95℃,12sec@70℃，8sec@72℃；9x 1sec@95℃，12sec@68℃，8sec@72℃；3x 1sec@95℃，12sec@66℃,8sec@72℃；40个欠严谨的荧光获得循环：40x 1sec@95℃,8sec@56℃,30sec@67℃,and 30sec@72℃；1个熔解循环：1x 1sec@95℃,10sec@38℃，@85℃持续收集荧光；降温循环：1x 1sec@38℃。

8.一种所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述反转录PCR扩增设置反应条件包括：反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得循环和1个降温循环；

反转录：1x 30min@55℃；预变性：1x 2min@95℃；18个温度递减的高严谨循环：6x 1sec@95℃,12sec@70℃，8sec@72℃；9x 1sec@95℃，12sec@68℃，8sec@72℃；3x 1sec@95℃，12sec@66℃,8sec@72℃；40个欠严谨的荧光获得循环：40x 1sec@95℃,8sec@56℃,30sec@67℃,and 30sec@72℃；降温循环：1x 1sec@38℃。

9.权利要求1-4任一项所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒在基孔肯雅热病中的应用。