[发明专利]一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法

权利要求书

1.一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)待原代培养分离后的脂肪间充质干细胞融合度达到80-90％，吸去细胞培养皿中培养液，向每个培养皿内加PBS进行清洗后，吸去培养皿中的PBS；

2)消化：在培养皿加入tryplE，转移至CO₂培养箱孵育1-2min后，加入无血清培养基，用巴氏吸管反复吹打10-15次，待80-90％的细胞不再贴壁，终止消化；

3)离心：将步骤2得到细胞悬液转移至离心管中，1000rpm/min离心5min；

4)计数：离心结束后，弃去上清液，用无血清培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，得到细胞悬液，取20μl用细胞计数仪计数；

5)铺板及培养：将步骤(4)的细胞悬液接种到无血清培养基中，调整细胞密度为1.3×10⁴/cm²,加入无血清培养基，无血清培养基中添加EGF，EGF的浓度为10ng/ml；转移至CO₂细胞培养箱中进行培养。

2.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，步骤(1)所述PBS是沿着培养皿壁加入，不得直接冲洗培养皿底部；

步骤(1)所述清洗是加入PBS后培养皿要前后、左右晃动大于10次。

3.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，步骤(2)所述tryplE的用量为培养基总体积一半以内，最低用量为达到覆盖培养皿底部。

4.根据权利要求3所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，所述tryplE的用量为在φ10cm培养皿中加入2ml的tryplE或者在φ15cm培养皿中加入3ml的tryplE。

5.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，步骤(2)所述无血清培养基的用量等于或者大于tryplE用量。

6.根据权利要求5所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，步骤(2)所述无血清培养基的用量为在φ10cm的培养皿中加入3ml的无血清培养基或者在φ15cm的培养皿中加入5ml的无血清培养基。

7.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，无血清培养基为UltraCULTURE MEDIUM。

8.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，步骤(4)所述无血清培养基的用量为5ml。

9.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，步骤(4)所述细胞悬液计数前首先与0.4％的台盼蓝染色液按照体积比1:1混合，染色后1h内计数。

10.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，步骤(5)所述加入无血清培养基与EGF后，要前后和左右晃动培养皿混匀5-10次。