[发明专利]一种利用重组大肠杆菌合成聚3-羟基丙酸的方法

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌菌株，其特征在于，在大肠杆菌基因组上整合甘油脱水酶及其激活因子的合成基因，以及dhaT基因，重组后的大肠杆菌菌株具有生物合成聚3-羟基丙酸与1,3-丙二醇的能力。

2.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌菌株，其特征在于，所述dhaT基因是以肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为模板，用引物ZG-440和ZG-441克隆得到的。

3.一种权利要求1所述重组大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1：质粒pET21(A)的构建：以肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为模板，用引物ZG-440和ZG-441克隆dhaT基因，dhaT片段与质粒pWQ02经HindIII、XhoI酶切后连接；

步骤2：质粒pRE112(B)的构建：以E.coliBL21的基因组为模板，分别利用引物ZG-268和ZG-269、引物ZG-270和ZG-271扩增出片段prpR基因两侧同源片段，再以两个扩增片段为模板，利用引物ZG-268和ZG-271扩增出片段prpR；限制性内切酶SacI和NheI酶切prpR后，将其连接到经过限制性内切酶SacI和XbaI酶切后的质粒pRE112，构建成重组质粒pRE112(A)；再利用限制性内切酶XhoI和XbaI酶切重组质粒pRE112(A)和pWQ04，切胶回收质粒pRE112(A)和dhaB-gdrAB片段，进行酶连后，构建完成重组质粒pRE112(B)；

步骤3：第一次重组：以E.coli/pRE112(B)为质粒供体菌，以待突变菌种E.coliBL21(DE3)作质粒受体菌；将供体菌和受体菌进行活化后，各取1.5mL，离心后用无菌水重悬洗2次，以除去抗生素，再用500μL的无菌水重悬菌体沉淀后各取100μL并混匀，离心后用50μL的1％DAP重悬菌体，涂布于无抗性平板，于37℃培养12h；收集平板上的菌体重悬到无菌水中；将重悬菌液稀释10^-1-10^-4倍，各倍数均取30μL涂布于氯霉素平板上，于37℃培养24h；PCR验证单克隆菌落，标记阳性菌；

步骤4：第二次重组：将标记的一次重组阳性单克隆接入无抗性LB试管，于37℃培养15h；将菌液稀释10^-1-10-⁶倍，各倍数均取20μL涂布于10％蔗糖平板上，37℃培养12h；挑选蔗糖板上的单克隆菌落，分别划到氯霉素平板和10％蔗糖平板，37℃培养10h；选取蔗糖平板上生长而氯霉素平板未生长的菌做PCR验证，标记阳性菌；划蔗糖平板分离单克隆2次，确保二次重组菌纯净；最终将PCR验证正确、并在氯霉素LB试管中检测不生长的菌，于-80℃保存。

4.一种权利要求1所述重组大肠杆菌菌株合成聚3-羟基丙酸的方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1：将所述重组大肠杆菌菌株在LB培养基中活化；

步骤2：活化后，转入1/5装液量的500mL带挡板的三角摇瓶中进行培养基发酵，接种量1％，同时加入100mg/L氨苄青霉素钠和34mg/L氯霉素，37℃、200r/min培养，OD600达到0.6-1.0时加入IPTG(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside)，以及0.03g/L维生素B12并将培养温度调整到30℃；培养72h；

步骤3：72h后，离心收集菌体，用无菌水和95％的乙醇清洗菌体沉淀；冷冻干燥至恒重得到细胞干重；

步骤4：在室温条件下，向冷干菌体中加入10倍菌体量的丙酮溶剂混合洗涤一次，蒸发干燥后，将干菌体包好置于索氏提取器中，加入10倍菌体量的氯仿，90℃萃取4h，萃取完毕后静置冷却，过滤，吸取上清液得澄清聚3-羟基丙酸溶液；

步骤5：使用旋转蒸发仪在45℃将氯仿蒸出，蒸馏烧瓶底部的析出物即为提取纯化得到的3-羟基丙酸聚合物，60℃干燥12h，完全除尽残留氯仿，获得3-羟基丙酸。

5.根据权利要求4所述重组大肠杆菌菌株合成聚3-羟基丙酸的方法，其特征在于，步骤1所述LB培养基组成为：胰蛋白胨10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH 7.0。