[发明专利]一种固定化耦联双酶制备L-叔亮氨酸的方法

权利要求书

1.一种固定化耦联双酶制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)制备纤维素载体；

(2)制备固定化耦联双酶：具体包括：

1)构建对接模块标记的亮氨酸脱氢酶基因的E.coli工程菌，上述对接模块标记的亮氨酸脱氢酶基因序列如SEQ ID 1所示，

2)构建对接模块标记的甲酸脱氢酶基因的E.coli工程菌，上述对接模块标记的甲酸脱氢酶基因序列如SEQ ID 2所示，

3)构建支架蛋白基因的E.coli工程菌，上述支架蛋白基因序列如SEQ ID 3所示，

4)依次通过培养、IPTG诱导表达和超声破胞，分别分离获得步骤1)、2)和3)构建的E.coli工程菌中表达的对接模块标记的亮氨酸脱氢酶、对接模块标记的甲酸脱氢酶和支架蛋白；

5)将上述获得的对接模块标记的亮氨酸脱氢酶、对接模块标记的甲酸脱氢酶、支架蛋白和纤维素载体混合并在10～40℃吸附10～100min，离心弃上清液，沉淀用含有0.5～50mM的CaCl₂和NaCl且pH为6.0～11.0的HEPES缓冲液洗涤，获得固定化耦联双酶；

(3)将上述固定化藕联双酶与底物和辅酶在pH＝6.0～11.0的NH₄Cl-NH₃缓冲体系中反应，制备L-叔亮氨酸。

2.如权利要求1所述的一种固定化耦联双酶制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于：所述步骤(1)为：取0.2g～10g微晶纤维素，加入0.5～10mL去离子水溶解后，缓慢加入预冷的磷酸至磷酸终浓度为20％～85％，冰浴0.5h～5h并搅拌，再加入冰水20～200mL，离心弃上清，用冰水洗涤，最后调pH至中性，即得所述纤维素载体。

3.如权利要求1所述的一种固定化耦联双酶制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于：所述步骤(1)的步骤1)包括：

a、以含亮氨酸脱氢酶基因的质粒pUC18-ldh为模板，用引物LDHCt-F1和LDHCt-R1进行PCR扩增，得到如SEQ ID 4所示的亮氨酸脱氢酶基因片段，其中LDHCt-F1和LDHCt-R1分别如SEQ ID 5和SEQ ID 6所示；

b、以质粒pET20b-ctdoc为模板，用LDHCt-F2和LDHCt-R2为引物进行用PCR扩增，得到得到如SEQ ID 7所示的第一对接模块基因片段，其中LDHCt-F2和LDHCt-R2分别如SEQ ID 8和SEQ ID 9所示；

c、以上述亮氨酸脱氢酶基因片段和第一对接模块基因片段为模板，用引物LDHCt-F1和LDHCt-R2进行overlap PCR扩增，得到对接模块标记的亮氨酸脱氢酶基因；

d、用NdeⅠ和SalⅠ分别双酶切对接模块标记的亮氨酸脱氢酶基因及pET20b质粒，用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌E.coli DH5α，然后提取质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)构建对接模块标记的亮氨酸脱氢酶基因的E.coli工程菌。

4.如权利要求1所述的一种固定化耦联双酶制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于：所述步骤(1)的步骤2)包括：

a、以含甲酸脱氢酶基因的质粒pUC18-fdh为模板，用引物FDHCc-F1和FDHCc-R1进行PCR扩增，得到得到如SEQ ID 10所示的亮氨酸脱氢酶基因片段，其中FDHCc-F1和FDHCc-R1分别如SEQ ID 11和SEQ ID 12所示；

b、以质粒pET20b-ccdoc为模板，用FDHCc-F2和FDHCc-R2为引物进行用PCR扩增，得到得到如SEQ ID 13所示的第二对接模块基因片段，其中FDHCc-F2和FDHCc-R2分别如SEQ ID 14和SEQ ID 15所示；

c、以上述甲酸脱氢酶基因片段和第二对接模块基因片段为模板，用引物FDHCc-F1和FDHCc-R2进行overlap PCR扩增，得到对接模块标记的甲酸脱氢酶基因；

d、用NdeⅠ和SalⅠ分别双酶切对接模块标记的甲酸脱氢酶基因及pET20b质粒，用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌E.coli DH5α，然后提取质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)构建对接模块标记的甲酸脱氢酶基因的E.coli工程菌。