[发明专利]基于特异性SS-COI引物的棉长管蚜PCR快速检测方法

说明书

一、技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种PCR检测方法，具体为基于棉长管蚜特异性SS-COI引物的PCR检测方法。

二、背景技术

棉长管蚜(Acyrthosiphon gossypii Mordvilko)，又叫棉无网长管蚜、大棉蚜，属同翅目，蚜科。为害棉花、骆驼刺、苦豆子、蚕豆、豇豆、绿豆、圆叶锦葵、甘草等。

棉长管蚜群集现象较弱，分散于棉株叶背、嫩枝和花蕾上，以刺吸式口器吸食棉花汁液。为害盛期在蕾铃期，受害部位出现失绿的细小点，叶片发生轻微卷曲，影响棉株发育，当虫口密度大时，大量消耗棉花体内营养，造成蕾铃脱落。

吕昭智等开展的新疆棉区棉蚜和棉长管蚜关系的研究中，文中提到棉长管蚜在国内仅分布于新疆和甘肃，为我国西北内陆棉区的特有种。其广泛分布在新疆的南部、北部棉区，严重地影响棉花的生产，成为新疆棉区中的主要害虫之一(中国棉花，2002，3：11-12)。

有效利用棉田自然天敌防治棉长管蚜是现代农业生产中重要的防治手段。棉田有许多捕食性天敌，如瓢虫类、草蛉类、食虫蝽类、蜘蛛等，明确棉田自然天敌对棉长管蚜的捕食作用，对于构建田间节肢动物营养食物网和确立优势天敌种类至关重要。研究天敌的捕食关系方法有直接观察法、肠胃分析法、生态能学分析等，这些传统手段很难准确开展食物营养关系的定量分析，且费时、费力、花费较高、不易重复等。

Species-Specific-COI PCR检测技术是在mtDNA COI技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用物种特异性COI引物(SS-COI)，根据预期DNA条带的有无来鉴定检测样本，无需测序和序列比对，其具有灵敏度高、特异性强、重复性好、快速、简便等优点。中国专利说明书CN103436618A公开的棉蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法即是该方法的具体应用。

但棉长管蚜为西北内陆棉区特有，分布区域有限，相关研究报道较少，在Genbank上检索不到COI基因片段。因此该方法尚未在棉长管蚜的检测方面得以应用。

三、发明内容

本发明的目的是提供一种基于特异性SS-COI引物的棉长管蚜PCR快速检测方法。

本发明根据棉长管蚜的线粒体DNA序列，设计一对棉长管蚜的特异性SS-COI引物，其包括：

正向引物Ag22F：5′-TCTTAATTAATAATGGTACG-3’

反向引物Ag22R：5′-ACCAGCTAAAACTGGTAGAG-3’

本发明棉长管蚜特异性快速PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)提取样品总DNA；

(2)以步骤1)提取的总DNA为模板，利用上述引物Ag22F和Ag22R进行PCR扩增反应；PCR反应体系以20μL计为：

PCR反应条件为：94℃3分钟，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分钟，共45个循环；之后72℃10分钟。

(3)分析PCR产物

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如出现大小为260bp的DNA扩增条带(SEQ ID No.3)，则表明样品为棉长管蚜。

本发明还提供含有引物Ag22F和Ag22R的用于检测棉长管蚜的试剂盒，所述试剂盒还包括棉长管蚜DNA标准阳性模板。

本发明是通过DNA条形码技术中的通用引物

LepF1：(5′-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’)和

LepR1：(5′-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’)

扩增出棉长管蚜的COI产物，经测序比对，进行引物设计，并多次筛选修正，得到上述一对特异引物。该引物特异性强，只针对棉长管蚜扩增出清晰、单一的长度为260bp的特异性条带，而对棉田中的其它昆虫无扩增效果。采用SS-COI PCR技术检测棉长管蚜，该技术操作简单、快速、高效，灵敏度较高，棉长管蚜的DNA最低检出浓度为0.170ng/μL。

本发明为棉长管蚜DNA分析提供了定性与定量分析的检测方法，用于植保领域确定棉长管蚜优势捕食天敌及明确食物链关系，准确性高，特异性强，操作简便快速。

四、附图说明

图1为本发明引物Ag22F/Ag22R对棉长管蚜特异性扩增效果图。其中，M：100bp DNA Iadder；1-64为表1中序号所对应昆虫的扩增结果，-为阴性对照。