[发明专利]基于特异性SS-COI引物的棉黑蚜PCR快速检测方法

说明书

一、技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及棉黑蚜PCR检测方法，具体为一种基于特异性COI引物的PGR检测方法。

二、背景技术

棉黑蚜(Aphis atrata Zhang)属同翅目，蚜科。又称紫团蚜。分布于新疆、宁夏、甘肃等地。寄主植物有棉花、苦豆子，少量在苜蓿上。

棉黑蚜是新疆棉花苗期害虫，喜群集于棉苗嫩头、子叶、真叶反面吸食汁液为害，使棉叶皱缩，生长点枯萎脱落，腋芽丛生，棉株矮化畸形，使棉苗发育早期停滞，花蕾减少，产量下降。

利用自然天敌对田间害虫进行生物防治，是农业生产中植保工作的有效手段之一。捕食性天敌对蚜虫具有明显的捕食作用，研究天敌对蚜虫捕食作用的方法很多，传统的方法主要采用田间直接观察，消化道解剖观察、以及生化方法，如酶联免疫法(ELISA)、同功酶电泳、蛋白质电泳分析等，但这些方法都有耗时长、操作复杂、费用高等局限性。目前，DNA追踪技术被逐步应用到研究田间天敌和害虫的食物链营养关系以及筛选优势天敌方面，是构建复杂的农业生态系统中节肢动物间食物网的有效工具之一。

Species-Specific-COI PCR检测技术是在mtDNACOI技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用物种特异性COI引物(SS-COI)，根据预期DNA条带的有无来鉴定检测样本，无需测序和序列比对，其具有灵敏度高、特异性强、重复性好、快速、简便等优点。中国专利说明书CN103436618A公开的棉蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法即是该方法的具体应用。

但棉黑蚜由于分布区域有限，相关研究开展较少，在Genbank上尚未检索到棉黑蚜CO1基因片段。因此该方法尚未在棉黑蚜的检测方面得以应用。

三、发明内容

本发明的目的是提供一种基于特异性SS-COI引物的棉黑蚜PCR快速检测方法。

本发明根据棉黑蚜的线粒体DNA COI序列，设计一对棉黑蚜的特异性COI引物，具体为

正向引物Aa105-1F：5’-TCCCATAATAATAGGTTGTC-3’

反向引物Aa105-1R：5’-TACCTGCTAAATGAAGAGAG-3’。

本发明的检测步骤为：

(1)提取样品总DNA；

(2)以上述步骤提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物Aa105-1F和Aa105-1R进行PCR扩增反应；反应体系以20μL计为：

反应条件为：94℃3分钟，94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，共45个循环；之后72℃10分钟。

(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如出现大小为210bp的DNA条带，则表明样品为棉黑蚜。

本发明还提供含有引物Aa105-1F和Aa105-1R的用于检测棉黑蚜的试剂盒，所述试剂盒还包括棉黑蚜基因组DNA标准阳性模板。

本发明是通过DNA条形码技术中的通用引物

LepF1：(5′-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’)和

LepR1：(5′-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’)

扩增棉黑蚜的线粒体COI基因，经测序，和其他大田常见蚜虫的COI序列进行比对，设计多条引物，从中筛选出一对特异引物。该引物特异性强，只有棉黑蚜能扩增出一条清晰、单一的长度为210bp的特异性条带，而对棉田中的其它昆虫无扩增效果。采用该技术检测棉黑蚜，准确性高，操作简单、快速，棉黑蚜的DNA最低检出浓度为0.192ng/μL。

四、附图说明

图1为本发明引物Aa105-1F/Aa105-1R对棉黑蚜特异性扩增效果图。其中，M：100bp DNA Iadder；1-64为表1中序号所对应昆虫的扩增结果，-为阴性对照。

图2为本发明棉黑蚜特异性引物Aa105-1F/Aa105-1R的DNA浓度梯度检测结果图。其中，M：100bp DNA Iadder；1-5为棉黑蚜DNA模板浓度49.1ng/μL依次稀释4倍的浓度梯度，-为阴性对照。

五、具体实施方式

以下实例均按照常规分子生物学实验条件，以及按照产品说明书建议的条件进行操作。

第一部分，引物Aa105-1F/Aa105-1R对棉黑蚜的扩增

(1)棉黑蚜总DNA的制备