[发明专利]一对特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及两条特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用。

背景技术

2010年，斯坦福大学的Simon Hippenmeyer及其研究团队在小鼠的第11号染色体上分离并鉴定出了一个良好的基因插入位点，命名为hipp11位点，简称H11位点。H11位点位于Eif4enif1与Drg1两个基因的间隙，与Eif4enif1基因的19号外显子和Drg1基因的9号外显子相邻，大小约5kb。H11位点由于位于两个基因之间，因此安全性较高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。实验证实Hipp11位点定点基因修饰的小鼠与野生型小鼠生长发育无区别。目前类似的还有Ros26位点，但是该位点为一个基因，其启动子为全身性广谱表达，难以做到组织特异性表达，然而H11位点则不存在类似的困难，由于其位于两基因之间，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达，更好的达到任务目标。如果在猪的基因组中定位hipp11这样安全有效的基因修饰位点，将有利于稳定转基因猪培育的技术体系。

ZFN和TALEN打靶技术是目前研究较为成熟的两种定点突变技术，但是这两种技术构建程序较为繁琐，每一个位点需要构建一对相应的核酸酶，而CRISPR/Cas9系统对特异位点的识别靠小的crRNA的引导，CRISPR区可以有一系列的crRNA组成，每个针对特异位点的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于ZFN和TALEN载体，更加容易构建。

(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong等及Mali等证明Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组(NHEJ)、同源重组(HR)效率在3-25％之间，与TALEN酶切效果相当。他们还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。 但是，随后的研究表明，Cas9存在较为明显的脱靶效应，麻省理工学院Feng Zhang团队使用双切刻技术将Cas9的特异性提高了50倍以上(Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9for enhanced genome editing specificity.Cell.Ran et al，2013)，维护了Cas9在基因打靶技术领域的地位。借助于这一技术，动植物基因功能研究及育种等等都将得到迅猛的发展。

发明内容

本发明针对猪的H11位点设计了一对特异性识别猪H11位点的sgRNA，本发明还提供了其相应的编码DNA和应用。本发明是利用编码这对sgRNA部分序列的短片段DNA构建表达载体，该表达载体能够表达出这对sgRNA,这对sgRNA能够特异性地识别猪H11位点。本发明还利用这对sgRNA引导Cas9n核酸酶(即Cas9切刻酶)对猪H11位点进行准确、高效地靶向修饰。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一对特异识别猪H11位点基因的sgRNA，由sgRNA-L和sgRNA-R组成；sgRNA-L和sgRNA-R分别由101个核苷酸组成，其中5’末端20nt的RNA片段(分别命名为sgRNA-L20和sgRNA-R20)可以识别染色体上特定的DNA序列，其余81nt称为骨架RNA片段。骨架RNA片段可形成发夹结构，与Cas9n核酸酶结合，从而引导Cas9n核酸酶切割靶标DNA单链，两个单链切口导致双链断裂(DSB)，细胞利用自身修复功能，使得靶标位点附近的序列发生变化；另外，这对sgRNA识别的DNA靶序列呈“头对头”的排布方式(即二者的5’末端相互靠近)，二者相距4bp，即有4bp的间隔。

sgRNA-L的识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下1)或2)：

1)序列表中的序列1所示的核苷酸序列；

2)将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列；

sgRNA-R的识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下3)或4)：

3)序列表中的序列2所示的核苷酸序列；