[发明专利]一种高产L-丝氨酸重组谷氨酸棒杆菌的构建及其发酵方法

说明书

技术领域

高产L-丝氨酸菌株谷氨酸棒杆菌的构建及其发酵工艺，本发明涉及微生物利用糖质原料生产L-丝氨酸的方法，属于生物技术领域。

背景技术

L-丝氨酸属于非必需氨基酸，具有重要的生理功能和应用价值，广泛应用于医药、食品和化工领域。目前L-丝氨酸的生产主要依赖于蛋白水解法、酶法转化法及微生物前体发酵法，然而这些方法存在产量小，生产成本高，环境污染大等问题，不适合进行大规模工业化生产L-丝氨酸。微生物发酵法利用可再生的糖质原料直接代谢生产L-丝氨酸是一种绿色环保可持续的生产方式，已经成为研究L-丝氨酸工业化生产的热点。然而这种生产方法由于受到菌株的限制，始终没有获得进一步的突破，这也使得L-丝氨酸成为瓶颈氨基酸。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) 是重要的氨基酸生产菌株，广泛应用于发酵法生产谷氨酸、赖氨酸和缬氨酸等。谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的主要代谢网络图见图1。目前在构建高产L-丝氨酸的菌株研究中，主要集中于解除L-丝氨酸对L-丝氨酸合成途径关键酶3-磷酸甘油酸(PGDH)的反馈抑制现象，降低L-丝氨酸的降解途径等。本实验室以一株诱变的谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a (CGMCC No. 8667) 通过解除L-丝氨酸对PGDH的反馈抑制，降低L-丝氨酸的降解的手段获得了能够利用蔗糖直接发酵生产L-丝氨酸的重组菌株SYPS-062-33a SS。与此同时，在L-丝氨酸合成的途径中存在着代谢流的竞争现象，过量的改变代谢流流向L-丝氨酸途径会导致减少代谢流流向丙酮酸途径和三羧酸循环，这会显著的降低谷氨酸棒杆菌的生长速率。通过代谢工程的手段虽然能够有效的提高L-丝氨酸的糖酸转化率，但是由于减少了代谢流流向三羧酸循环会导致谷氨酸棒杆菌生产速率降低，直接影响L-丝氨酸的生产效率，不利于工业化生产L-丝氨酸，这也成为微生物发酵法生产L-丝氨酸亟需解决的难题。为了解决代谢流过量流向L-丝氨酸途径导致L-丝氨酸的生产效率降低的问题，本专利提出了代谢工程改造和发酵工艺相结合的策略，一方面通过代谢工程手段转变代谢流从糖酵解途径流向L-丝氨酸合成途径，提高了L-丝氨酸的糖酸转化效率；另一方面通过添加营养成分满足代谢改造后导致的谷氨酸棒杆菌对营养物质的需求，解决菌体生长缓慢的问题，提高L-丝氨酸的生产强度。

发明内容

本发明的目的是为了提高谷氨酸棒杆菌利用可再生的糖质原料(如蔗糖)产L-丝氨酸的产量，糖酸转化率和生产强度。通过代谢工程的手段改变蔗糖代谢流量流向L-丝氨酸途径，提高L-丝氨酸产量和糖酸转化率，同时通过添加营养成分玉米浆提高谷氨酸棒杆菌的生长速率和蔗糖消耗速率，使L-丝氨酸的生产强度得到进一步提高。本发明选用的菌株为保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年12月31日，保藏编号为CGMCC No.8666，分类命名为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）33a SS。

选择将代谢流流向L-丝氨酸竞争途径，即支链氨基酸方向的关键酶缬氨酸：丙酮酸氨基转移酶的编码基因avtA在基因组水平上进行敲除，随后进一步对代谢流流向该途径的限速酶乙酰羟酸合酶(AHAS)在基因组水平上进行了弱化，使代谢流成功的从支链氨基酸方向流向了L-丝氨酸合成方向，最终获得了一株缬氨酸：丙酮酸氨基转移酶敲除，乙酰羟酸合酶弱化的重组谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a SS avtAC-T ilvN。将该菌株在有添加营养成分玉米浆的发酵培养基上进行培养，能够有效的提高细胞的生长速率及L-丝氨酸的产量，糖酸转化率和生产强度。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

分别按照如下实验方案将avtA进行基因敲除和对乙酰羟酸合酶(AHAS)进行弱化，最后获得重组谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a SS avtAC-T ilvN。

1)      基因扩增：根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列信息，设计引物以谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a SS基因组DNA为模板，分别扩增目的基因上游序列和下游片段，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的片段，再将该片段连接至pMD19-T，对目的基因序列进行测序验证，确证重组克隆质粒序列的准确性；