[发明专利]产生和使用原胶原的方法

说明书

本申请是以下申请的分案申请：申请日：2009年4月16日；申请号：200980121650.9；发明名称：同上。

发明领域和背景

本发明在其一些实施方案中涉及包括原胶原的组合物，及其在促进伤口愈合、治疗纤维化和促进血管发生中的用途。

哺乳动物身体起始愈合应答以预防威胁生命的出血和感染的快速应答已进行进化以确保存活，通常以受损组织的有效再生为代价。伤口愈合过程需要不同阶段，一些是顺次的，而其他的是伴随的。然而，所有阶段在受损组织部位处小心地配合，以再生具有正常功能性的组织。事件顺序涉及凝固、炎症、组织沉积(迁移和增殖)和最终组织重建。

在组织损伤时，血液从受损血管中释放，从而导致具有血小板陷入其内的血纤蛋白纤维网格形成。网格充当被募集的细胞朝向其和遍及其移动的支架。活化的血小板脱粒且释放趋化试剂，包括细胞因子和生长因子例如转化生长因子-β1(TGF-β1)，从而导致成纤维细胞和角质形成细胞的募集。在损伤后几天，通过沉积新胶原基质，成纤维细胞开始代替受损组织。胶原纤维在厚度中逐步增加，并且沿着伤口的应激线(stress line)排成一行。在正常瘢痕形成中，胶原纤维一般与表皮平行排列。通过肌成纤维细胞，这个新形成的肉芽组织最终组构且收缩成更致密的结构。

瘢痕通常由于伤口愈合应答的正常进展形成，并且由在愈合过程期间沉积的结缔组织组成。大多数瘢痕显示一定程度的异常组构(如皮肤瘢痕中可见)和结缔组织的量(如中枢神经系统瘢痕中可见)。然而，正常组织生产级联中的改变导致小于最佳的伤口愈合，伴随瘢痕形成组织的过量沉积，导致瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕形成，也称为纤维化。肥厚性瘢痕的特征在于过量胶原沉积，改变的胶原重建和收缩，并且不同于瘢痕疙瘩瘢痕之处在于它们限定在伤口部位的边界内。

转化生长因子-β1(TGF-β1)在这些愈合过程中起重要作用，并且已报告介导成纤维细胞转变为肌成纤维细胞。这个成纤维细胞亚型的特征在于α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达，并且与伤口收缩有关。TGF-β1通过上调原胶原的mRNA稳定性和表达来诱导胶原沉积。此外，它通过抑制基质金属蛋白酶(MMPs)表达，同时诱导组织金属蛋白酶(TIMPs)抑制剂表达来减少胶原降解率。

除MMP/TIPMP平衡外，胶原分子对此种酶促活性的可接近性也是决定胶原降解率中的重要因素。这种可接近性主要由胶原的组构状态(螺旋单体与组构成原纤维的单体比较)和胶原三股螺旋之间的交联程度决定。

I和III型胶原是原纤维形成性胶原，其构成大量皮细胞外基质。胶原作为原胶原前体合成，其中3个胶原多肽卷曲到彼此内，形成三股螺旋。这些螺旋随后在胶原原纤维生物合成的最后一个步骤时连接在一起。I型原胶原由2条α1胶原链和单条α2链组成。III型由3条α1链构成。

在所有纤维胶原分子中，3条多肽链由重复Gly-X-Y三联体构成，其中X和Y可以是任何氨基酸，但通常是亚氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸。原纤维形成性胶原的重要特征是它们作为包含球形N和C末端延伸前肽的前体原胶原合成。

每个原胶原分子在粗面内质网内由其3条组成成分多肽链装配。当多肽链共翻译地转运越过内质网膜时，在Gly-X-Y重复区内发生脯氨酸和赖氨酸残基的羟基化。一旦多肽链完全转运到内质网的腔内，3条前α链就经由其C前肽结合以形成三聚分子，从而允许Gly-X-Y重复区在其C末端上形成成核点，确保链的正确排列。Gly-X-Y区随后以C至N方向折叠以形成三股螺旋。

C-前肽以及在较少程度上的N-前肽在其离开细胞的过程中维持原胶原可溶性[Bulleid等人，Biochem Soc Trans.2000；28(4):350-3]。在原胶原分子分泌到细胞外基质后或在该过程中，前肽一般通过原胶原N和C蛋白酶切割，从而触发胶原分子自发自装配成原纤维[Hulmes，2002 J Struct Biol.137(1-2):2-10]。

前肽通过原胶原N和C蛋白酶的去除急剧降低原胶原的可溶性，并且是起始胶原在37℃自装配成纤维所必需的。对于这个装配过程关键的是称为端肽的短的非三股螺旋肽，其是N和C末端前肽在用N/C蛋白酶消化后的残留部分。通过降低对于自装配所必需的临界浓度，这些肽作用于确保胶原分子在原纤维结构内经由其可交联醛的正确共价对准(Bulleid等人，2000，同上)。