[发明专利]鸭甲肝病毒III型弱毒株及由其制备的活疫苗和应用

说明书

技术领域

本发明涉及鸭甲肝病毒毒株，尤其涉及一株分离的鸭甲肝病毒III型强毒株以及由该强毒株连续传代选育得到的鸭甲肝病毒III型弱化毒株，本发明还涉及该鸭甲肝病毒III型弱化毒株在制备预防鸭甲肝病毒III型活疫苗中的应用，属于鸭甲肝病毒毒株的分离及应用领域。

背景技术

鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV)是鸭病毒性肝炎的致病病原。国际病毒分类系统于2010年4月修订：鸭肝炎病毒命名为鸭甲肝病毒DHAV(DHAV)，属小RNA病毒科，禽肝炎病毒属。目前DHAV分为3个血清型，即：血清I型，血清II型和血清III型。其中血清I型为传统鸭肝炎病毒，血清II型和血清III型为近几年发现的新型病毒株，分别对应台湾新型和韩国新型。3个血清型之间无交叉反应。

随着DHAV I型鸡胚化弱毒疫苗、高免卵黄抗体的研制成功及临床应用，使本病在很大程度上得到很好的控制。但近几年，在中国山东、河北、广东等地免疫接种过DHAV I型弱毒疫苗或注射过DHAV I型高免卵黄抗体的鸭群中仍发生鸭肝炎，死亡率为20％-80％。经病毒分离鉴定为血清III型，即韩国新型。

因此，目前亟需要研制一种能够有效预防DHAV III型的活疫苗。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)III型强毒株；

本发明的目的之二是将所分离的鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)III型强毒株通过传代致弱筛选得到一株弱毒疫苗株；

本发明的目的之三是利用筛选的弱毒疫苗株制备得到有效预防鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)III型的活疫苗。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先分离了一株鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)III型毒株，命名为DHAV III型JS株(DHAV-JS)。

本发明将分离的DHAV III型毒株JS株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.6852；分类命名是：鸭甲肝病毒；保藏时间是：2012年11月13日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。

DHAV-JS株的PCR检测结果显示：在约714bp处出现了特异性的DNA条带。DHAV-JS株VP1基因序列为SEQ ID NO.1所示。利用DNAMAN软件，将JS株VP1基因序列与参考毒株的相应序列进行比较，结果显示：JS株与DHAV血清I型VP1的基因序列核苷酸同源性在62.0％～64.4％之间，JS株与DHAV血清II型VP1的基因序列核苷酸同源性在63.6％～63.8％之间。进化树分析表明，所分离到的JS株与SD02株(DHAV血清III型病毒)的亲缘关系较近。

本发明将分离的DHAV-JS株经过10日龄SPF鸭胚38℃培养5代，10日龄SPF鸭胚37℃培养12代，9日龄SPF鸡胚37℃适应培养13代，9日龄SPF鸡胚37℃弱化27代，最终筛选获得一株性能最优良的DHAVIII型鸡胚弱化毒株JS57株。

本发明将选育的DHAV III型鸡胚弱化毒株JS57株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9708；分类命名是：鸭甲肝病毒III型；保藏时间是：2014年09月28日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所筛选的鸭甲肝病毒III型鸡胚弱化毒株JS57株能够应用于制备预防由鸭甲肝病毒III型所导致的鸭病毒性肝炎的疫苗。

本发明公开了一种预防鸭病毒性肝炎的疫苗组合物，包括预防上有效量的鸭甲肝病毒III型鸡胚弱化毒株JS57株和药学上可接受的冻干保护剂。

本发明进一步公开了一种制备鸭甲肝病毒III型活疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)培养DHAV III型鸡胚弱化毒株JS57株，得到病毒液；(2)在病毒液中加入冻干保护剂，研磨滤过；(3)加入抗生素，充分混合，定量分装；(4)冷冻真空干燥，即得。

其中，步骤(1)将DHAV III型鸡胚弱化毒株JS57株接种9日龄SPF鸡胚，挑选在孵育24～96小时之间死亡的胚胎，收集病毒液。