[发明专利]一种土壤微生物基因组的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种土壤微生物基因组的提取方法。

背景技术

土壤微生物是土壤生物中的一类非常重要的类群，是气候和土壤环境条件变化的敏感指标，土壤微生物群落多样性和结构及其变化在一定程度上反映了土壤的质量。在20世纪70年代以前，土壤微生物多样性解析技术主要依靠细胞的培养分离和形态分析，即通过人工配制的简单营养基质对土壤中的微生物进行定时定温培养，然后对生长的菌落进行计数、并通过形态构造和生理生化特性来鉴定种属。毕竟这种方法只能培养土壤中0.2-5％的微生物，土壤中微生物的多样性无法得到体现。近年来，分子生物学的快速发展使研究者可以不再依赖于微生物的分离培养技术，而是在基因组DNA水平上对复杂的微生物系统进行分析研究。分子生物学研究的内容有琼脂糖凝胶电泳、核酸凝胶电泳、核酸分子杂交、核苷酸序列分析、基因扩增等，这些技术都是基于DNA水平上的，对基因的纯度要求较高。由于来自环境的样品含有极其复杂的成分，如腐殖酸类物质连同被吸附的有机分子一起与DNA共同被萃取，还有土壤中的重金属离子等对后续的PCR(聚合酶链反应)和杂交、凝胶电泳和细菌转化产生很大的影响。在大多数宏基因组研究中，分离出不含有腐殖酸类物质的宏基因组DNA的技术还有待改进。

目前许多土壤微生物总DNA的提取方法已经报道了很多，大致可分为直接法和间接法提取。两种方法各有优缺点，间接法虽说提取的DNA纯度较高，但它得到的细菌只占菌落的少部分；而直接法是直接从土壤中裂解细胞，提取的DNA超过细菌总DNA的70％，但目前传统方法(TSA I Y L，OLSON B H.Rapid method for diceet extraction of DNA from soil and sediments[J].Applied and Environment Microbiology，1991，57(4):1070-1074.)操作步骤太多，导致DNA产量低，且最后得到的DNA性能不稳定。

发明内容

为克服现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种土壤微生物基因组的提取方法，提取的DNA产量高，并且性能稳定，可直接用于后续PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种土壤微生物基因组的提取方法，包括以下步骤：

(1)将土壤加入到离心管中，并加入氢氧化钙水溶液，振荡使土样分散，得到土壤混合液；其中，土壤与氢氧化钙水溶液中氢氧化钙的比为(5-10)g：(10-20)mmol；

(2)向土壤混合液中加入磷酸盐溶液和氢氧化钠溶液，振荡使土壤中的细胞释放，然后进行离心，收集沉淀；其中，土壤与磷酸盐溶液中磷酸盐、氢氧化钠溶液中氢氧化钠的比为(5-10)g：(0.1-0.25)mmol：(0.1-0.25)mmol；

(3)向沉淀中加入DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液，然后于60-70℃下加热后得到溶液A；其中，沉淀、DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液的加入量比为(0.5-1.5)g：(500-1500)μL：(30-90)μL：(20-60)μL；

(4)向溶液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡至溶液变成乳浊液后进行离心，吸取上清液；其中，氯仿与异戊醇的混合物的体积是溶液A体积的0.8-1.2倍；

(5)向上清液中加入乙醇水溶液并进行离心，将所得沉淀晾干或烘干，得到DNA粗提物，将DNA粗提物进行纯化，得到基因组DNA。

所述将DNA粗提物进行纯化的具体过程为：将DNA粗提物溶解于无菌水中，然后加入洗涤液并进行离心，吸取上清液A；向上清液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡混匀，并于4℃下离心，吸取上清液B，向上清液B中加入乙醇溶液，并于4℃下离心，所得沉淀即为基因组DNA；其中，氯仿与异戊醇的混合物的体积为上清液体积的0.8-1.2倍；氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24：1。

所述洗涤液为BaCl₂和CaCl₂的水溶液，且水溶液中BaCl₂与CaCl₂的总浓度为0.5-1mol/L，且BaCl₂与CaCl₂的摩尔比为1:1、2:1或1:2。

所述步骤(1)中Ca(OH)₂水溶液的浓度为1-2mol/L；振荡的时间为2-5min。