[发明专利]一种检测大熊猫西氏贝蛔虫的酶联免疫试剂盒

权利要求书

1.一种检测大熊猫西氏贝蛔虫的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有包被重组抗原构成的酶标板，酶标二抗，小鼠阴性对照血清，感染西氏贝蛔虫小鼠阳性对照血清，底物溶液，洗涤液；其中，所述包被重组抗原为重组蛋白rBs-GST-1，所述酶标二抗为羊抗鼠-HRP二抗，以上液体均分装在试剂盒中。

2.根据权利1所述的一种检测大熊猫西氏贝蛔虫的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述重组蛋白rBs-GST-1是通过克隆、表达大熊猫西氏贝蛔虫的Bs-GST-1蛋白而获得的重组蛋白rBs-GST-1。

3.根据权利1或2所述的一种检测大熊猫西氏贝蛔虫的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述重组蛋白rBs-GST-1能与西氏贝蛔虫感染的小鼠阳性血清发生免疫反应，具有反应源性。

4.根据权利1所述的一种检测大熊猫西氏贝蛔虫的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述重组抗原的包被稀释度达到1:12800时，OD₄₅₀值显著。

5.根据权利1所述的一种检测大熊猫西氏贝蛔虫的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述对照阳性血清稀释度达到1:12800，抗原包被稀释度为1:12800时，OD₄₅₀值显著。

6.根据权利1所述的一种检测大熊猫西氏贝蛔虫的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗,其在50min时，稀释度1:3000时OD₄₅₀为0.987，且P/N值最大。

7.根据权利1或2所述的一种检测大熊猫西氏贝蛔虫的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述重组蛋白rBs-GST-1按照以下方法制备，步骤包括：

（1）Bs-GST-1基因的扩增：采用高通量测序技术获得的西氏贝蛔虫基因组和发育转录组数据，鉴定和筛选出编码Bs-GST-1的转录本，然后以此为模板利用 Primer 5.0软件设计特异性PCR扩增引物：

上游引物：5’-AAGCAACATGCCGCAGTACAAG-3’；

下游引物：5’-CACAAAAAACAGAATAGACCCTAATA-3’；

经PCR扩增出Bs-GST-1基因；测序得到长647bp片段序列，其ORF框长为621bp；

（2）利用DNAStar软件分析出表达序列蛋白分子量是22.65915kDa，理论等电点pI为7.449；

（3）氨基酸序列分析、结构预测：利用DNAStar软件对西氏贝蛔虫GST-1蛋白进行氨基酸序列分析，编码为199个氨基酸；其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

（4）GST-1基因的克隆载体构建：设计加酶切位点引物，通过PCR扩增出约600bp大小的片段；

（5）重组质粒的酶切；通过设计的两个酶切位点引物对重组质粒pMD19-T-GST-1进行提取；

（6）表达载体的构建；将上述质粒通过胶回收后与原核表达载体pET-32a(+)连接，构建pET32a(+)-GST-1重组表达质粒，转化入表达菌BL21中，经单菌落PCR鉴定与测序，并扩大培养提取质粒，再次双酶切鉴定，从而确定表达载体构建成功；

（7）表达质粒pET32a(+)-Bs-GST-1诱导表达；经过表达条件优化，重组蛋白的纯化，诱导表达的菌体经超声波破碎仪破碎后，经SDS-PAGE鉴定pET32a(+)-Bs-GST-1表达蛋白以包涵体形式存在，得到重组蛋白rBs-GST-1。